Tratat genetica: capitolul 6

Tratat genetica: capitolul 6

Comentarii oprite

 

CAPITOLUL  6

 

VARIABILITATEA  GENETICĂ

 

 

 

                Genetica este ştiinţa eredităţii şi a variabilităţii. Dacă ereditatea determină conservarea informaţiei genetice şi deci a similitudinii biologice dintre părinţi şi copii, variabilitatea creează deosebirile dintre generaţii. Dar diferenţele fenotipice dintre indivizi pot fi produse fie de modificări ale materialului genetic, fie de factori din mediul înconjurător. Prin variabilitate genetică se înţelege ansamblul de fenomene care produc diferenţele genetice  între indivizii unei populaţii precum şi între populaţii diferite. Datorită acestor diferenţe se creează diversitatea, premisă esenţială a evoluţiei.

                Consecinţele fenotipice ale diferenţelor ce pot apărea în secvenţa ADN la diferiţi indivizi au un spectru larg: unele nu au efect fenotipic sau acesta este minim, altele pot produce direct o stare de boală; între aceste două extreme se plasează variaţile fenotipice normale determinate genetic ale morfologiei şi fiziologiei organismului, ale comportamentului şi personalităţii individului, ale răspunsului său la factorii externi (de la alimente, la agenţi cauzatori de boală sau medicamente). Deci bolile genetice sunt numai partea cea mai evidentă, extremă, a variabilităţii genetice.

 

A.      SURSELE  DE  VARIABILITATE

 

Variabilitatea genetică este produsă prin mutaţii, recombinări şi migraţii. Aceste trei fenomene sunt interconectate: mutaţiile determină modificări în structura materialului genetic al unui individ şi creează fondul genetic caracteristic unei populaţii; migraţiile unor persoane dintr-o populaţie în altă populaţie aduc un potenţial genic nou iar recombinările din gametogeneză şi fecundare produc un „amestec” al zestrei genetice parentale într-o combinaţie nouă, specifică descendentului. Cert este că genomul uman nu este o entitate statică, fixă.

 

1.       MUTAŢIILE

 

Termenul de mutaţie a fost folosit pentru prima oară în genetică de către Hugo de Vries, în 1901. Prin  mutaţie se înţelege orice modificare în secvenţa sau aranjarea nucleotidelor din ADN. Aceste modificări sunt nenaturale (accidentale), permanente şi ereditare. Dacă interesează ADN genic, ele pot produce o schimbare detectabilă a fenotipului (dar acest lucru nu este obligatoriu). Celula sau organismul ce prezintă o astfel de modificare se numeşte mutant.

În funcţie de mărimea materialului genetic interesat – genă, cromosom, genom – mutaţiile se pot clasifica în trei mari categorii:

(1)     Mutaţii genice, care afectează secvenţa nucleotidelor unei gene; ele pot interesa întreaga genă sau o parte a ei  (rearanjări intragenice) sau numai o pereche sau câteva perechi de nucleotide (mutaţii punctiforme), formând o variantă alelică a genei normale („de tip sălbatic”); frecvenţa mutaţiilor genice este apreciată la 10-5 – 10-6 /locus/generaţie.

(2)     Mutaţii cromosomice, care produc schimbări în structura cromosomilor şi deci în ordinea liniară a genelor în cromosomi (remanieri cromosomice: pierderea, câştigul sau rearanjarea unor segmente); mutaţiile cromosomice se produc cu o frecvenţă de 10-4 /diviziune celulară.

(3)     Mutaţii genomice („de ploidie”), care afectează cantitatea de material genetic şi se traduc printr-o modificare a numărului diploid de cromosomi întregi; ele afectează fie 1-2 perechi de cromosomi (aneuploidie), fie toţi cromosomii, prin adăugarea a 1-2 seturi haploide (poliploidie). Mutaţiile genomice sunt cele mai frecvente mutaţii la om, 10-2 /diviziune celulară.

Ultimele două tipuri de mutaţii sunt reunite într-un singur grup numit anomalii cromosomice.

                O altă clasificare a mutaţiilor se bazează pe tipul de celule afectate: germinale (ce vor forma, în gonade, celule sexuale) sau somatice. În cazul, mutaţiilor germinale, se pot produce gameţi anormali care (în cazul în care individul este fertil), după fecundare, transmit mutaţia la generaţia următoare, rezultând un individ ale cărui celule vor fi toate mutante; mutaţiile germinale sunt deci ereditare. În al doilea caz, cel al mutaţiilor somatice, descendenţii unei celule mutante vor forma o clonă celulară anormală, prezentă în anumite ţesuturi, rezultând un mozaicism somatic; mutaţiile somatice nu pot fi transmise generaţiilor viitoare.

În funcţie de cauză, mutaţiile pot fi clasificate în spontane şi induse. Mutaţiile spontane sunt cele mai numeroase şi se produc prin erori de copiere în cursul replicării ADN. Deşi funcţia de autocorecţie a ADN polimerazelor reduce semnificativ numărul de erori, mărimea enormă a genomului uman face ca la orice replicare a celor 3 miliarde de nucleotide să apară erori (10-10). Mutaţiile induse sunt determinate de agresiunea unor substanţe chimice exogene, a radiaţiilor ionizante sau a metaboliţilor reactivi. Urmările acestor atacuri genotoxice sunt reduse prin intervenţia unor sisteme eficace de supraveghere, alarmă şi reparare; dovada nedorită a eficacităţii lor este adusă de mutaţiile genelor implicate în aceste procese ce cresc semnificativ rata mutaţiilor, producând – cel mai -  adesea cancere.

Consecinţele fenotipice ale mutaţiilor formează un spectru foarte larg.

§       Cele mai multe mutaţii germinale (produse în regiunile necodante ale ADN) nu au un efect fenotipic, sunt mutaţii neutre. Ele generează variantele alelice ce alcătuiesc polimorfismul ADN, dacă un locus are mai mult de o variantă (alelă) ce se întâlneşte în populaţie cu o frecvenţă mai mare de 1% (ce face ca producerea ei întâmplătoare să fie improbabilă). Heterozigoţia medie a ADN genomic la om a fost apreciată la 0,001 – 0,004 (adică 1:250 – 1:1000 pb diferă prin secvenţele alelice). De notat că unele gene, şi în special genele HLA, au un polimorfism înalt.

§       Uneori mutaţiile noi pot avea efecte benefice, producând o mai bună adaptare la mediu şi/sau o rezistenţă mai mare la agresiunile ecologice sau o creştere a „aptitudinilor reproductive” („fitness”). Avantajul selectiv al heterozigoţilor (Na), purtători ai unei gene mutante, se poate înscrie în această categorie (vezi capitolul 7). Cert este că mutaţiile reprezintă „combustibilul brut care conduce evoluţia”.

§       Deseori mutatiile pot fi patogene, producând o modificare fenotipică evidentă (letală, subletală, morbidă) sau crescând susceptibilitatea la boală.

Până acum ne-am referit la mutaţiile germinale, care sunt ereditare. Deşi mutaţiile somatice nu se transmit la descendenţi, nu înseamnă că medical nu sunt importante. Evoluţia de la zigot la adult necesită circa 1015 diviziuni celulare; la o frecvenţă medie de 10-10 erori de replicare per diviziune se produc în genomul fiecărei celule somatice mii de mutaţii. Efectul lor va depinde de natura mutaţiei, localizarea şi ţesutul implicat; ele vor produce clonele anormale implicate în cancer, afectări degenerative sau „îmbătrânire” precoce.

Consecinţele patogene ale mutatiilor, germinale şi somatice, ne permit să afirmăm că mutaţiile sunt cauza principală de boală la om.

 

2.       RECOMBINĂRILE  GENETICE

 

Prin reombinare genetică înţelegem producerea unor combinaţii genetice noi (recombinanţi), prin rearanjarea (reasortarea, redistribuţia) materialului genetic cuprins în două unităţi genetice diferite.

                Recombinarea genetică este un proces natural şi reprezintă „una din cheile mecanismelor prin care se formează noi indivizi ce vor fi apoi testaţi, prin selecţie naturală, în marea schemă a evoluţiei biologice” (Wetzel, 1980).

                Procesul de recombinare necesită o asociere intimă şi apoi o interacţiune între două unităţi genetice diferite; această „condiţie” permite, între altele, diferenţierea dintre recombinările genetice şi mutaţii. În funcţie de mărimea unităţilor implicate în replicare – genom, cromosom, genă – se pot deosebi mai multe tipuri de recombinare.

 

            RECOMBINAREA  GENOMICĂ.

Recombinarea genomică se realizează în cadrul procesului sexual, prin asortarea  genomurilor din gameţii care unesc, pentru a forma zigotul. Reproducerea sexuată asigură nu numai continuitatea şi păstrarea genelor şi caracterelor de la părinţi la copii, dar şi creşterea variabilităţii urmaşilor. Când se unesc doi gameţi proveniţi de la indivizi neînrudiţi, diferiţi genetic, descendenţii vor prezenta o vitalitate sporită, calităţi noi, o adaptabilitate mai bună şi o fertilitate crescută. Această vigoare hibridă sau heterozis este consecinţa heterozigotismului care se creează la descendenţi. În cazul încrucişării între indivizi apropiaţi sau înrudiţi (consanguinitate), gradul de heterogenitate se reduce şi creşte fenomenul de omogenizare genetică (vezi capitolul 5.D.3). Deci recombinarea genomică este o importantă sursă de varibilitate, cu condiţia ca genomurile care se combină să fie cât mai diferite.

 

            RECOMBINAREA  CROMOSOMICĂ

Recombinarea cromosomică se produce în cursul gametogenezei între cromosomii omologi (cu origine diferită) prin fenomenele specifice meiozei I (vezi capitolul 5.C.1.c). Ea poate avea loc între cromosomi „întregi” (recombinare intercromosomică) sau între „părţi” din cromosomi (recombinare intracromosomică).

a. Recombinarea intercromosomică

 Recombinarea intercromosomică se produce în cursul anafazei I, atunci când cromosomii ce formează o pereche de omologi se separă şi apoi se dirijează spre celulele fiice independent de alte perechi de omologi. Prin această asortare independentă se formează 223 tipuri de gameţi, deci peste 8,4 milioane de gameţi diferiţi, la fiecare din cele două sexe. (această cifră este valabilă pentru situaţia în care cromosomii se deosebesc printr-o singură genă). După fecundare pot rezulta teoretic 246 combinaţii, valoare ce depăşeşte de opt mii de ori populaţia actuală a globului pământesc. Să nu uităm însă că fiecare cromosom are mai multe gene; de aceea se poate afirma că fiecare persoană are o structură genetică unică şi nerepetabilă. Asortarea independentă a cromosomilor omologi explică a doua lege a lui Mendel, referitoare la combinarea liberă a "factorilor ereditari" (genelor) şi distribuţia diferită a unor caractere, normale sau anormale, la descendenţi (vezi capitolul 5.D.1).

b. Recombinarea intracromosomică (“omologă”)

Variaţiile genotipice individuale produse prin recombinarea intercromosomică sunt amplificate prin schimbul reciproc şi egal de gene dintre cromosomii omologi care se produce prin crossing-over, în profaza I (vezi capitolele 3.A.2; 5.C.1 şi caseta 6.1). Prin această recombinare intracromosomică sau omologă cromosomii omologi, care iniţial erau diferiţi ca origine, suferă o recombinare a genelor parentale.

 

            RECOMBINAREA  INTRAGENICĂ

Recombinarea  intragenică  se produce printr-un crossing-over egal între două gene alele şi produce o genă hibridă sau o fuziune genică,  ce conţine un fragment terminal dintr-o alelă şi restul de secvenţă din cealaltă alelă (figura 6.1). Recombinarea intragenică poate produce şi fenomenul de conversie genică,  la care ne vom referi ulterior. 

 

CASETA 6.1

 

                      Mecanismul recombinării intracromosomice

 

                Procesul de recombinarea intracromosomică, o sursă majoră de diversitate genetică, are loc printr-un mecanism molecular care este doar parţial înţeles, dar asemănător cu cel al recombinării omologe responsabile de repararea rupturilor ADN bicatenare (vezi figura 6.23).

                Înainte de iniţierea procesului de crossing-over este necesară împerecherea cromosomilor omologi. Acest mecanism, care aduce în imediata vecinatate secvenţele ADN ce vor fi schimbate în cadrul crossing-over, pare a fi reglat independent de recombinarea propriu-zisă. Procesul de recombinarea este iniţiat prin producerea în profaza meiozei a unor rupturi ADN bicatenare în câteva puncte de-a lungul fiecaruia din cele patru cromatide de către endonucleaza SPO11, proteina înrudită cu topoizomerazele II. SPO11 formează o legătura fosfodiester între un aminoacid tirozina şi nucleotidul din poziţia 5' de la nivelul punctului de ruptură. Aceste puncte de ruptură par a nu apare întâmplător de-a lungul cromosomilor ci mai frecvent în regiunile promotor ale genelor şi preferential în regiunile cromosomice bogate în perechi de baze GC. Consecinţele defectelor SPO11 au fost evidenţiate pe modele animale şi constau în alterarea formării chiasmatelor şi aneuplodie masivă cu imposibiliatea formării unor gameţi funcţionali.

                Ulterior are loc îndepărtarea SPO11 şi procesarea capetelor rupte sub acţiunea 5' – 3' exonucleazică a unui complex proteic format cel puţin din proteinele RAD50 si MRE11. Aceasta conduce la formarea unor capate protruzive 3', monocatenare, situate de fiecare parte a unei rupturi. Unul dintre aceste capete protruzive 3' va invada apoi o cromatida a cromosomului omolog şi acelaşi proces va fi realizat de către capatul protruziv 3' opus pentru cealaltă cromatidă a cromosomului omolog. Aceste proces este controlat de către proteinele DMC1 si RAD51. Urmează un proces de reparare a dublei joncţiuni tip Holliday formate cu participarea unor ADN polimeraze si ADN ligaze.

                Etapa finală a acestui proces este rezoluţia joncţiunilor Holliday care este esenţială pentru separarea cromosomilor patern şi matern şi evidenţierea recombinanţilor. Aceasta etapă presupune intervenţia unor rezolvaze încă neidentificate.

 

 

3.       MIGRAŢIILE

 

Prin migraţii se înţelege transferul de gene prin deplasarea unui grup de indivizi dintr-o populaţie în altă populaţie genetic diferită. Prin imigrare se produce astfel o introducere a unor gene noi în populaţia gazdă. Asupra acestui mecanism ne vom referi pe larg în capitolul următor, Genetica populaţiilor, dar vom preciza aici că migraţiile au reprezentat şi în specia umană o sursă importantă de variaţii ereditare.

 

B.       MUTAŢIILE  GENICE

 

                Mutaţiile sunt definite ca modificări permanente şi ereditare în secvenţa nucleotidelor sau aranjarea ADN. Prin aceste modificări se produc variante alelice ale secvenţei de ADN (genă sau secvenţă extragenică). Unele dintre aceste variante nu au efect fenotipic sau acesta este mi nim; alte variante alelice, produse prin mutaţie,  pot fi implicate direct în etiologia unor boli.

                Introducerea metodelor de analiză a ADN a permis, în ultimii 20 de ani,   realizarea unor progrese remarcabile în identificarea şi studiul mutaţiilor răspunzătoare de producerea unor boli monogenice. S-a putut defini astfel spectrul mutaţiilor pentru aceste boli, atât calitativ (tipurile şi poziţiile mutaţiilor, precum şi efectul lor asupra funcţiei genei) cât şi cantitativ (analiza frecvenţei mutaţiilor în diferite populaţii sau epidemiologia moleculară). Consecinţele au fost multiple şi pot fi grupate în trei categorii:

§       Cunoaşterea teoretică mai precisă a diversităţii mecanismelor mutaţionale ce operează la om şi descoperirea unor mecanisme noi (transpoziţii, inversii, expansiuni de repetiţii trinucleotidice);

§       Înţelegerea mai precisă a mecanismelor patogenice ale unor boli (pierderea totală sau parţială a funcţiei proteinelor, modificarea sau achiziţia unor proprietăţi noi ale proteinelor codificate de genele mutante);

§       Ameliorarea calităţii şi eficienţei diagnosticului în numeroase boli monogenice, precum şi a sfatului genetic şi diagnosticului prenatal.

 

1.        TIPURI  ŞI  MECANISME  DE  PRODUCERE  ALE  MUTAŢIILOR  GENICE

 

Mutaţiile care afectează regiuni mici din genom pot fi împărţite în două mari clase:

§       modificări ale unei secvenţe unice de ADN sau mutaţii simple; acestea sunt de obicei microleziuni, interesând unul sau câteva nucleotide;

§       modificări ce implică schimburi între două secvenţe alelice/nealelice de ADN sau recombinări genice aberante; ele generează macroleziuni (mari deleţii, inserţii, duplicaţii, inversii mari, fuziuni de gene) interesând o parte din genă sau chiar întreaga genă

În funcţie de modificarea produsă în secvenţa de nucleotide a ADN se pot deosebi trei mari categorii de mutaţii (figura 6.2):

§       substituţii nucleotidice – ce implică de regulă înlocuirea unei singure perechi de baze; mai rar  pot fi înlocuite simultan mai multe nucleotide grupate, rezultând o formă de conversie genică;

§       deleţii – eliminarea (pierderea) unuia sau mai multor nucleotide din secvenţa genei, mai rar părţi din genă (exoni) sau întreaga genă;

§       inserţii – introducerea (adiţia) unuia sau mai multor nucleotide în structura genei; rar se pot produce inserţii largi (prin transpoziţie), amplificarea (expansiunea) unor secvenţe repetitive trinucleotidice sau duplicaţia genei.

Majoritatea mutaţiilor sunt modificări stabile/fixe ale secvenţei ADN. Recent s-a descris o clasă nouă de mutaţii numită mutaţii instabile sau dinamice în care anumite repetiţii trinucleotidice suferă modificări (de obicei expansiuni) atunci când sunt transmise în succesiunea generaţiilor.

În funcţie de tipul secvenţelor din structura genei care sunt afectate, mutaţiile pot interesa secvenţele codante (exonii) sau necodante (intronii, secvenţele reglatoare), cu efecte variate asupra expresiei informaţiei ereditare şi implicit asupra sintezei de proteine (alterarea structurii sau cantităţii).

Descrierea diferitelor tipuri de mutaţii se bazează pe o nomenclatură specifică, stabilită de grupuri de experţi, prezentată în caseta 6.2..

 

CASETA 6.2

Nomenclatura  mutaţiilor

 

                Nomenclatura mutaţiilor a fost stabilită de către Genome Database Nomenclature Commitee şi poate fi accesată la adresa http://www.gene.ucl.ac.uk/nomenclature/  Mutaţiile pot fi descrise în două modalităţi: prin efectul lor sau prin descrierea secvenţei modificării.

Nomenclatura pe baza efectului alelei mutante este folosită mai ales la organismele de laborator. O alelă nulă sau amorfă nu produce nici-un efect; o alelă hipomorfă produce o cantitate sau o activitate redusă a produsului genei; o alelă hipermorfă determină o cantitate sau activitate crescută de produs; o alelă neomorfă este o alelă cu activitate sau produs nou; o alelă antimorfă este o alelă a cărei activitate sau produs antagonizează activitatea produsului normal.

Nomenclatura pentru descrierea mutaţiei este amplă (vezi Antonarakis et al.,1998). Vom prezenta aici câteva repere.

Substituţiile de amino acizi.  Reziduurile de aminoacizi (desemnaţi prin codul de trei litere sau cel cu o singură literă[1]; vezi tabelul 4.2) sunt numărate începând cu metionina (corespunzătoare codonului iniţiator) considerată numărul 1. Astfel mutaţia cu sens greşit în codonul 6 al genei pentru β-globină şi substituţia acidului glutamic cu valina ce produce sicklemia se scrie: Glu6Val sau E6V. O mutaţie non sens ce înlocuieşte glutamina din poziţia 39 a β-globinei cu un „codon stop”, producând o formă trunchiată a β-globinei şi determinând βo-talasemia, se scrie Gln39X sau Q39X

Substituţiile nucleotidice. În descriere se va scrie mai întâi baza originală, numărul nucleotidului cu această bază, simbolul mai mare (>) şi apoi noul nucleotid din poziia respectivă.  Numărul nucleotidului se calculează de la primul nucleotid A din codonul iniţiator (start) ATG care este +1 (nucleotidul precedent este -1; nu există nucleotid 0). Dacă este necesar se va folosi g. şi c. pentru a indica o secvenţă de ADN genomic sau ADN complementar.

De exemplu, o mutaţie cu sens greşit  se poate scrie G1444>A (uneori se mai scrie 1444G>A)

Pentru modificări în introni, se va specifica numărul intronului (desemnat cu iniţialele IVS de la „intervening sequence”), numărul nucleotidului (+1, +2) începând cu situl donor 5’ sau invers (-1, -2) de la situsul 3’acceptor. D ex., IVS33+2T>A reprezintă o mutaţie în intronul 33 în situsul donor, ăn care T este înlocuită cu A.

Deleţiile şi inserţiile. Deleţiile mici sunt indicate prin termenul „del” scris după numerele nucleotidelor deletate; de ex., 1524-1527del sau 1524-1527delAGTA – deleţia a 4 nucleotide (AGTA). Pentru a preciza modificarea aminoacizilor atunci se scrie mai întâi simbolul lor. De ex., F508del semnifică deleţia fenilalaninei în poziţia 508 (această modificare frecventă în mucoviscidoză s-a scris iniţial ΔF508, semnul delta semnificînd deleţie). Inserţiile mici sunt desemnate similar cu termenul „ins” după cele două nucleotide între care se produce inserţia, urmat de nucleotidele inserate. De ex., 1277-1278insTATC denotă inserţia a patru baze între nucleotidele 1277 şi 1278, o cauză comună a bolii Tay-Sachs

 

 

1.1     SUBSTITUŢIA  UNUI  NUCLEOTID

 

Înlocuirea unui singur nucleotid (şi deci a unei perechi de baze în ADN bicatenar) este o mutaţie punctiformă şi reprezintă cel mai frecvent tip de mutaţie întâlnită la om. Astfel, din circa 130 de variante anormale ale hemoglobinei umane, 120 sunt produse prin substituţii.

a). Tranziţii şi transversii.

Se deosebesc două tipuri de substituţii: tranziţiile care reprezintă înlocuirea unei baze pirimidinice (T sau C) sau purinice (A sau G) cu o bază de acelaşi tip şi transversiile în care o bază pirimidinică (T sau C) este înlocuită de o bază purinică (A sau G) şi vice versa. Teoretic, presupunând că substituţia se face la întâmplare, transversiile ar trebui să fie de două ori mai frecvente decât tranziţiile, deoarece orice bază poate suferi două transversii dar numai o singură tranziţie (figura 6.3) . În realitate, tranziţiile sunt mai frecvente ca transversiile; excesul de tranziţii este determinat probabil de acţiunea combinată a ADN polimerazei (ce poate încorpora eronat în procesul de replicare mai frecvent o bază de acelaşi tip) şi acţiunii sistemelor de corecţie (care recunosc mai uşor o încorporare de tipul transversiei, ce antrenează o modificare mai importantă a diametrului moleculei de ADN, decât tranziţia).

Printre tranziţii, cele ce interesează dinucleotidul CpG (sau 5’-CG-3’) sunt mai frecvente decât celelalte dinucleotide (TpG sau CpA), reprezentând cam o treime din toate substituţiile. Acest dinucleotid CpG se găseşte mai ales în regiunile reglatoare ale transcripţiei (promotor), sub forma unor insule CpG, iar C situată în poziţia 5’ faţă de G este frecvent metilată. În plus, citozina suferă deseori o dezaminare spontană transformându-se în uracil, un component anormal al ADN care este uşor recunoscut şi îndepărtat prin mecanismele de corecţie. Dacă dezaminarea interesează metil-citozina, aceasta este transformată în timină, o bază normală din structura ADN; în acest caz eroarea nu va fi uşor de recunoscut şi corectat, producând o tranziţie C→T sau G→A în funcţie de catena ADN implicată (figura 6.4). Dinucleotidul CpG constituie deci „un punct fierbinte” de producere a mutaţiilor în genomul uman; într-adevăr tranziţiile în acest dinucleotid au fost găsite, în diferite boli, de 10-20 ori mai frecvent comparativ cu alte dinucleotide[2] şi circa 30% din toate substituţiile unui singur nucleotid sunt de acest tip.

b). Efectele substituţiei asupra informaţiei genetice.

Efectele substituţiei unui nucleotid depind de localizarea intragenică a mutaţiei: secvenţe codante, secvenţe intragenice necodante şi secvenţe reglatoare (vezi capitolul 3.B.1).

În regiunile codante (exoni) substituţia se poate face într-un codon sens sau nonsens şi modifică codonul respectiv, putând să-i schimbe semnificaţia (figura 6.5).

(1) Substituţia într-un codon sens poate produce:

§       Un  codon sens sinonim, care semnifică acelaşi aminoacid; mutaţia este fără efect asupra polipeptidului codificat de genă (care va rămâne nemodificat), este neutră din punct de vedere fenotipic şi evolutiv, şi se numeşte mutaţie silenţioasă (mută) sau mutaţie sinonimă;

§       Un alt codon sens care semnifică un aminoacid diferit; acest tip de mutaţii nesinonime, care alterează „sensul” unui codon, se numesc mutaţii cu sens greşit („missens”). Ele se împart în două grupe:

-          substituţii conservative, când este înlocuit un aminoacid cu altul care este chimic şi funcţional similar, (face parte din aceeaşi grupă; de ex., lizina şi arginina sunt aminoacizi bazici); adesea, efectul acestei substituţii asupra funcţiei proteinei este minim (ambii aminoacizi au funcţii similare);

-          substituţii neconservative, când este înlocuit un aminoacid cu altul care este chimic şi funcţional diferit; acest tip de mutaţii este frecvent (50%) în patologia genetică la om.

§       Un codon nonsens sau stop prematur, care nu semnifică nici-un aminoacid; se formează un ARNm mai scurt şi, dacă acesta este stabil, o proteină  „trunchiată” (de obicei instabilă şi degradabilă[3]); mutaţiile nonsens constituie aproximativ 12% din toate mutaţiile ce produc boli la om.

(2) Substituţia într-un codon nonsens poate produce:

§       Un codon sens care semnifică un aminoacid; deci codonul stop este anulat, transcripţia continuă până la următorul codon stop şi se formează un ARNm mai lung, care va codifica o proteină anormal de lungă.

§       Rareori rezultă un alt codon stop (UAA→UAG) şi mutaţia este fără efect asupra proteinei.

c). Consecinţele substituţiei în raport cu localizarea intragenică                

Efectele substituţiei unui nucleotid depind de localizarea intragenică a mutaţiei: secvenţe codante, secvenţe intragenice necodante şi secvenţe reglatoare (figura 6.6).

(1) Secvenţele codante sunt afectate în marea majoritate a mutaţiilor patogene. Predomină substituţiile nucleotidice nesinonime, în special mutaţiile cu sens greşit, care modifică:

- stabilitatea proteinei, localizarea intracelulară, maturarea proteinei, asamblarea ei în structuri multimerice,

- interacţiunile cu liganzii sau alte proteine,

- situsul funcţional pentru activitatea enzimatică etc).

Totuşi, foarte rar, o substituţie sinonimă (de obicei neutră) poate cauza un efect patogen prin activarea unui situs criptic de decupare/matisare (asemănător celor din introni) care va determina excluderea unei părţi a exonului din ARNm. Remarcăm, de asemenea, că unii exoni pot avea în zonele cu dinucleotide CpG o rată mare de mutaţii.

(2) Secvenţele necodante intragenice, şi în special intronii, pot fi sediul unor mutaţii (în circa 10-15% din mutaţiile patogenice). Astfel, alterarea (prin substituţie) a situsurilor de decupare a intronilor (în engleză – splice site mutations) – situsul donor (5’-GT) sau acceptor (AG-3’) – face ca excizia să se producă la următorul exon şi, ca atare,  în ARNm matur se va încorpora o parte sau întregul intron sau va lipsi un exon (în engleză – exon skipping), în funcţie de situsul afectat. Ambele situaţii au consecinţe importante asupra expresiei genei (ARNm instabil; polipeptid nefuncţional). Ocazional au fost descrise mutaţii patogenice şi în secvenţele 5’UTR (hemofilia B Leyden) sau 3’UTR, transcrise dar netranslate, din primul şi ultimul exon; ele pot modifica rata sintezei proteice.

(3) Secvenţele reglatoare pot suferi mutaţii care, evident, modifică rata transcripţiei (dacă afectează elementele promotorului şi interacţiunea lor cu factorii de transcripţie) sau stabilitatea moleculei de ARNm formate (când afectează situsul de poliadenilare din regiunea 3’) şi deci cantitatea de proteină sintetizată; astfel de mutaţii se întâlnesc în talasemii.

                d). Mecanismele posibile de producere a substituţiilor

                Substituţiile nucleotidice pot fi produse fie spontan, prin erori în procesul normal de replicare a ADN, fie prin leziuni provocate în ADN de factori mutageni (chimici sau fizici).

§       Erorile de replicare ale ADN apar prin împerecherea greşită a nucleotidelor (vezi 5.A.3.6). Ele sunt îndepărtate rapid prin procesul de corecţie fie de către ADN polimeraza δ, fie prin alte mecanisme de reparare; în final, rămîn puţine erori de replicare, aproximativ o mutaţie nouă la fiecare diviziune celulară.

§       Mutaţiile pot apărea şi prin procese chimice spontane de depurinare, dezaminare, demetilare sau după expunerea la mutageni chimici sau fizici (radiaţii ionizante sau ultraviolete).

 

1.2      DELEŢII  ŞI  INSERŢII  MICI

 

Un al doilea tip major de mutaţii este reprezentat de către deleţiile sau inserţiile  a unul sau mai multe nucleotide; ele reprezintă circa un sfert din toate mutaţiile responsabile de producerea bolilor genetice la om.

§       Dacă deleţiile sau inserţiile sunt un multiplu de trei nucleotide se produce lipsa sau adiţia unor aminoacizi în proteină. Un exemplu interesant este cel al mutaţiei ΔF508 (sau F508 del, după nomenclatura actuală), ce produce aproape 70% din cazurile de fibroză chistică la Europeni; prin deleţia a trei perechi de nucleotide din gena CF rezultă pierderea fenilalaninei (F) din poziţia 508 a proteinei CFTR (vezi capitolul 11.B.4).

§       Atunci când numărul nucleotidelor deletate sau inserate nu este un multiplu de trei se produce o decalare (defazare) a cadrului de lectură al genei, de la locul în care s-a produs deleţia sau inserţia (figura 6.7); să ne reamintim că citirea informaţiei genetice se face continuu, în grupe de trei nucleotide sau codoni adiacenţi, formaţi prin simpla grupare câte trei (vezi 4.B.3.a). Acest tip de mutaţii (în engleză frameshift mutations), produc frecvent un codon stop în aval  de locul deleţiei/inserţiei, rezultând o proteină trunchiată.

Deleţiile şi inserţiile  câtorva nucleotide survin cel mai adesea la nivelul unor secvenţe scurte repetate în tandem, printr-un mecanism de glisare sau derapare replicativă (în engleză slipped strand mispairing), determinat de împerecherea decalată a acestor secvenţe repetate. Aşa cum se observă în figura 6.8, secvenţele repetate din catena nou sintetizată (de ex., CAG CAG…), se pot alinia greşit (glisează înainte sau înapoi) faţă de secvenţele repetitive complementare corespunzătoare ale catenei ADN matriţă (de ex., GTC GTC…). În funcţie de direcţia de glisare se produc în catena nou sintetizată inserţii (prin glisarea spre înapoi) sau deleţii (prin glisare spre înainte). Acest fenomen de glisare replicativă se produce frecvent în cazul microsateliţilor sau minisateliţilor determinând polimorfismul cunoscut al acestor secvenţe repetate în tandem de un număr variabil de ori (VNTR). El ar putea fi la originea expansiunii repetiţiilor trinucleotidice (vezi secţiunea 1.4). Unele gene implicate în etiologia unor boli (gena CF – pentru CFTR implicat în fibroza chistică; gena FIX – pentru factorul IX implicat în hemofilia B; gena APC – pentru polipomatoza adenomatoasă de colon, ş.a) posedă în secvenţa codantă o serie de repetiţii în tandem ale unui număr mic de nucleotide (figura 6.9), ce pot fi implicate în fenomenul derapării replicativ, producând deleţia sau inserţia unităţii repetitive, fapt ce va genera decalarea cadrului de lectură (o mutaţie frameshift).

 

1.3. REMANIERI   GENICE  ABERANTE

 

Remanierile genice aberante se realizează prin schimburi între secvenţe de ADN identice sau cvasi-identice, alelice sau nealelice şi generează deleţii şi inserţii mari, duplicaţii, inversiuni şi conversii genice. Comparativ cu alte tipuri de mutaţii descrise mai înainte, remanierile genice sunt mai rar întâlnite în etiopatogenia bolilor genetice dar relativ frecvente în anumite boli. De ex., 90% din cazurile de amiotrofii spinale infantile şi 60% din cazurile de miopatie Duchenne sunt produse prin deleţii genice importante.

a). Recombinări genice prin recombinare omologă nealelică (inegală sau ectopică).

Mecanismul principal al remanierilor genice este recombinarea omologă nealelică (RON)(sau ectopică) între secvenţe identice sau cvasi-identice situate (în câteva exemplare) în amplasări diferite ale cromosomilor (figura 6.10). Ea se produce de obicei în profaza meiozei I atunci când cei doi cromosomi omologi se împerechează greşit (prin secvenţele lor identice) – RON meiotică (intercromosomică) –  sau, mai rar, în mitoză, prin schimb fie între cromosomii omologi, fie între cromatidele surori – RON somatică (intracromosomică sau intracromatidiană). Această recombinare (intermoleculară) poate duce fie la un schimb reciproc (CO) inegal (figura 6.11) prin care se modifică ambele cromatide (deleţie sau duplicaţie „în oglindă”; inversie), fie la o conversie genică care este un transfer unidirecţional de informaţie şi se modifică numai una dintre cromatide. Poate exista şi o recombinare intracromatidiană, între secvenţe omologe situate pe aceeaşi cromatidă. Aceste situaţii sunt ilustrate prin mai multe exemple.

§       Regiunea ce cuprinde gena ţintă este duplicată în tandem. Astfel, genele α1 şi α2 ce codifică lanţurile de alfa-globină ale hemoglobinei sunt produse printr-o duplicaţie recentă; împerecherea greşită α1-α2 (figura 6.12) va genera, prin CO inegal, deleţia sau duplicaţia unei gene α Aceeaşi situaţie se întâlneşte şi pentru gena SMN (de la survival motor neuron), duplicată în regiunea 5q11.2-13.3; prin CO inegal se produce deleţia exonilor 7 şi/sau 8 a genei, ceea ce generează amiotrofia spinală infantilă.

§       Conversia genică este produsă prin schimburi nereciproce (unidirecţionale), de mărime variabilă (de la cîteva pb la cîteva kb) între gene vecine, foarte asemănătoare dar neidentice. Ele se pot împerechea greşit şi atunci una din gene – donor (desori o pseudogenă, inactivată prin mutaţii) – ramâne neschimbată iar cealaltă – acceptor – este modificată primind  o parte din secvenţele donorului (figura 6.13). Exemplul cel mai tipic priveşte genele codante pentru 21-hidroxilază, CYP21A şi CYP21B, situate pe braţul scurt al cromosomului 6 în regiune HLA (vezi figura 3.3.c); numai gena CYP21B este funcţională, cealaltă genă – CYP21A – este o pseudogenă care a acumulat numeroase mutaţii inactivatoare. Circa 75% din cazurile de hiperplazie congenitală de suprarenală prin deficienţă de 21-hidroxilază sunt consecinţa mutaţiilor ce apar în gena CYP21B ca urmare a conversiei genice între pseudogena CYP21A şi gena funcţională CYP21B; restul cazurilor sunt produse prin deleţia genei CYP21B prin CO inegal (figura 6.14). Mecanismul de conversie genică pare implicat în generarea polimorfismului extrem al genelor complexului HLA.

§       Regiunea ce cuprinde gena ţintă este flancată/ încadrată de secvenţe repetitive scurte, identice, care prin împerechere greşită şi CO inegal vor genera deleţia sau duplicaţia genei (figura 6.15). De ex., gena pentru proteina mielinei, PMP22, se află într-o regiune de 1,5Mb flancată de secvenţe identice de circa 30Kb (vezi figura 5.18 şi capitolul 5.C.1.3). După CO inegal se produce duplicaţia şi deleţia genei PMP22 care va genera două neuropatii ereditare diferite: boala Charcot-Marie-Tooth 1A şi, respectiv neuropatia ereditară cu pareze induse de presiune (HNPP).

§       Repetiţiile dispersate nealelice (de tip Alu) predispun la aliniere greşită, CO inegal şi producerea de deleţii/duplicaţii; acest mecanism a fost identificat în gena receptorului pentru LDL, gena NF1, gena factorului IX al coagulării şi altele .

§       Pe acelaşi cromosom, în interiorul sau vecinătatea genei ţintă se găsesc secvenţe identice; prin recombinare intracromosomică (deci intramoleculară) între două copii se poate produce deleţie sau inversii a unei mari părţi din genă. De ex., în intronul 22 al genei pentru factorul VIII al coagulării (Xp28) se află o mică secvenţă nucleotidică care se mai găseşte repetată, dar cu orientare opusă, de cel puţin două ori la extremitatea telomerică a genei (figura 6.16); prin recombinare între secvenţa intronică şi una din secvenţele omologe se produce o inversie a primilor 22 de exoni ai genei FVIII; această mutaţie recurentă produce circa 50% din cazurile severe de hemofilie A. Acelaşi fenomen se întâlneşte în boala Hunter, o mucopolizaharidoză legată de X.

Toate cazurile descrise mai sus fac parte din bolile genomice care sunt produse prin recombinarea omologă nealelică între regiuni specifice din genom, cu duplicaţii sau cu un număr mic de repetiţii identice sau foarte asemănătoare. Aceasta  pare să fie un mecanism frecvent (10-4) şi important de producere a unui nou tip de boli, numit boli genomice (Lupski, 1998) (vezi Caseta 6.3); ele sunt determinate de „arhitectura” specifică a genomului uman  şi prin aceasta se deosebesc de bolile monogenice convenţionale, produse prin mutaţii specifice într-o genă (de obicei consecinţa unor erori de replicare şi/sau reparare). In funcţie de mărimea segmentului genomic implicat şi de numărul de gene localizate în segmentul remaniat – deleţia şi/sau duplicaţia rezultată prin recombinare aberantă (intercromosomică, intracromosomică sau intracromatidiană; (figura 6.17)- poate produce: o boală mendeliană (tabelul 6.1), un sindrom al genelor contigue sau o aberaţie cromosomică a unui braţ întreg.

 

Tabelul 6.1. Bolile genomice Mendeleene

(adaptat după Stankiewicz şi Lupski, 2002)

 

Boală

 

Cod

OMIM

Mod de trans-mitere

Poziţie cromo-somică

 

Genă

Tip de rearanja-ment

Sindrom Bartter tip III

601 678

AD

1p36

CLCNKA/B

deleţie

Boală Gaucher

230 800

AR

1q21

GBA

deleţie

Nefronoftizie juvenilă familială

256 100

AR

2q13

NPHP1

deleţie

Distrofie musculară facio-scapulo-humerală

158 900

AD

4q35

FRG1?

deleţie

Atrofia musculară spinală

253 300

AR

5q13.2

SMN

inversie/

duplicaţie

Hiperplazia corticosuprarenală congenitală

tip III  (prin deficit de 21 hidroxilază)

201 910

AR

6q21.3

CYP21

deleţie

Aldosteronism cu răspuns la tratament cu glucocorticoizi (GRA)

103 900

AD

8q21

CYP11B1/2

duplicaţie

b-talasemie

141 900

AR

11p15.5

b-globină

deleţie

a-talasemie

141 800

AR

16p13.3

a-globină

deleţie

Boala polichistică renală tip 1 (ADPKD)

601 313

AD

16p13.3

PKD1

 

Boala Charcot-Marie-Tooth (CMTA1)

118 220

AD

17p12

PMP22

duplicaţie

Neuropatia ereditară cu sensibilitate la pareze presionale (HNPP)

162 500

AD

17p12

PMP22

deleţie

Neurofibromatoza tip 1 (NF1)

162 200

AD

17q11.2

NF1

deleţie

Nanism hipofizar

262 400

AR

17q23.3

GH1

deleţie

Deficit farmacogenetic al CYP2D6

124 030

AR

22q13.1

CYP2D6

deleţie/ duplicaţie

Ihtioză

308 100

LX

Xp22.32

STS

deleţie

Dicromatopsie pentru vederea colorată roşu/verde

303 800

LX

Xq28

RCP şi GCP

deleţie

Incontinentia pigmenti

308 300

LX

Xq28

NEMO

deleţie

Hemofilia

306 700

LX

Xq28

F8

inversie

Distrofia musculară Emery-Dreifuss (EMD)

310 300

LX

Xq28

Emerină şi FLN1

deleţie/ duplicaţie/ inversie

Sindromul Hunter (mucopolizaharidoza tip III)

309 900

LX

Xq28

IDS

inversie/ deleţie

 

b). Remanieri genice prin recombinare neomologă sau nelegitimă              

Remanierile genice se pot produce şi prin evenimente de recombinare neomologă sau nelegitimă între secvenţe care nu prezintă sau au o foarte mică omologie de secvenţă. Este cazul celor mai multe deleţii ale genei ce codifică distrofina. Nu se cunosc precis mecanismele moleculare ale recombinării nelegitime. Se crede că anumite elemente din structura genelor ar putea fi „puncte fierbinţi” pentru aceste recombinări: secvenţele alternante de purine-pirimidine, regiunile MAR (de la matrix-associated region) bogate în nucleotide A/T, situsurile de clivare ale topoisomerazelor, secvenţele în palindrom etc.

 

Caseta 6.3

Boli genomice

 

Bolile genomice sunt afecţiuni care rezultă prin rearanjarea ADN din genomul uman,  datorită recombinării dintre regiuni distincte omologe dar nealele („paraloge”) (Lubski, 1998); aceste rearanjamente determină pierderea sau duplicaţia unei gene (sau unor gene). Bolile genomice sunt deci consecinţa arhitecturii speciale a unor regiuni din cromosom (sau cromosomi) spre deosebire de bolile monogenice convenţionale, produse prin mutaţii specifice într-o genă (datorită erorilor de replicare şi/sau reparare).

          Rearanjările se produc prin recombinare omologă nealelică între regiuni specifice, de ~10-400 Kb, cu secvenţe identice sau asemănătoare. Acestea sunt  frecvent duplicaţii segmentare („dupliconi”) sau secvenţe cu un număr mic de repetiţii identice, localizate preferenţial în anumite segmente ale cromosomilor, frecvent la centromer sau telomere (estimări recente arată că ~5-10% din genomul uman este duplicat). Datorită omologiei lor, secvenţele respective se împerechează greşit şi determină prin recombinare omologă meiotică (intercromosomică) sau  mitotică (intracromosomică: schimb între cromatidele surori sau intracromatidiană) (figura 6.10) rearanjări cromosomice sau cromatidiene (deleţii, duplicaţii, inversii, disrupţii genice).

          Recombinarea omologă nealelică mediată de secvenţe repetitive mici este un fenomen frecvent (10-4) şi un mecanism major de producere a bolilor genetice. În funcţie de mărimea segmentului implicat (figura 6.17) şi de numărul de gene localizate în segmentul remaniat se pot produce: boli mendeliene (numeroase cazuri de: neurofibromatoza 1, nefronoftizia juvenilă familială, incontinentia pigmenti s.a.) (tabelul 6.1); sindroame cu microdeleţii (sdr. Williams, sdr. DiGeorge/Velocardiofacial etc); aberaţii cromosomice  mari (inversii,  isocromosomi X de braţ lung , cromosomi supranumerari bisatelitici etc).

          Folosirea unor metode noi de analiză (hibridizarea genomică comparativă – CGH – de înaltă rezoluţie, microcipuri cu BAC de genom uman) va duce probabil la descoperirea unor noi boli prin rearnjamente genomice submicroscopice.

 

1.4. EXPANSIUNEA  INSTABILĂ  A  REPETIŢIILOR  TRINUCLEOTIDICE

 

După anul 1991 s-au descoperit peste 10 boli genetice produse prin mutaţii instabile sau dinamice ale unor repetiţii trinucleotidice[4]; trei dintre acestea sunt relativ frecvente: retardul mintal cu X fragil  (FRAXA), distrofia miotonică (sau boala Steinert) şi boala (coreea) Huntington (tabel 6.2). Aceste afecţiuni se caracterizează prin expansiunea instabilă a unui segment de ADN ce conţine o repetiţie de trei nucleotide (CAG, CTG, CGG sau GAA), dispuse în tandem (deci adiacente); aceste repetiţii se pot găsi în exoni, la capetele 5’ sau 3’ ale genei, sau în introni.  Pe măsură ce gena trece de la o generaţie la alta, numărul de repetiţii trinucleotidice creşte progresiv, suferă o expansiune, şi când depăşeşte un anumit prag critic produce anomalii în expresia genei sau funcţia proteinei codificată de genă.

 

Tabelul 6.2. Exemple reprezentative de boli prin repetiţii  trinucleotidice

 

Boala

 

Localizarea

genei

 

Mod de

transmisie

 

Repetiţie

 

Localizarea repetiţiei

Număr de repetiţii

 

Efect parental

Alela

normală

Pre-mutaţie

Mutaţie

completă

Sindromul  X fragil (FRAXA)

(1:4000)

Xq27.3

DLX (anticipaţie)

CGG

5’UT

< 60

60-200

> 200

matern

Distrofia miotonică

(1:8000)

19q13.3

  AD

(anticipaţie)

CTG

3’UT

< 30

50-80

> 80

matern

Ataxia Friedreich

(1:50.000)

9q13

   AR

GAA

Intron 1

< 25

36 -100

> 100

matern

Boala Huntington

(1:12.000)

4p16.3

AD (anticipaţie)

CAG

Regiune codantă

< 36

?

> 35

patern

 

Identificarea acestui mecanism mutaţional nou a fost o surpriză deoarece:

§       se deosebeşte fundamental de restul mutaţiilor, permanente şi stabile care, o dată produse, acestea se transmit nemodificate în succesiunea generaţiilor şi sunt prezente la toţi bolnavii dintr-o familie;

§       iniţial se credea că acest tip de mutaţii dinamice nu se găsesc decât la om; ulterior au fost identificate şi la alte specii, dar mult mai rar;

Genomul uman conţine numeroase secvenţe repetitive care ocupă poziţii cromosomiale fixe (loci) şi a căror complexitate variază de la gene integrale (de ex., genele pentru ARN ribosomal) la tracturi formate prin repetarea unuia sau câtorva nucleotide (microsateliţi). Printre cele mai simple şi mai frecvente sunt repetiţiile unor mononucleotide SNP (de la single nucleotid polimorfism), repetiţiile dinucleotidelor AC, repetiţiile unor trinucleotide sau, mai rar, a unor secvenţe mai lungi   repetate succesiv, în tandem. Funcţiile repetiţiilor simple sunt încă neelucidate dar foarte probabil ele nu sunt “inerte” funcţional; Numărul de repetiţii variază de la un individ la altul, ceea ce face ca secvenţa respectivă să fie polimorfică în populaţie. Aceste secvenţe repetate sunt în general stabile, fiind transmise identic la generaţiile următoare şi putând servi atunci ca marker genetic.

         În unele cazuri, o repetiţie trinucleotidică moderat amplificată (probabil prin CO inegal) poate produce boală dar repetiţia este perfect stabilă şi se transmite fără modificări de mărime în mai multe generaţii; de ex. o expansiune trinucleotidică stabilă în gena HOXD13 produce o polisindactilie.

         În alte cazuri, numărul de repetiţii trinucleotidice al secvenţei poate să crească în succesiunea generaţiilor, realizând o expansiune progresivă sau brutală a secvenţei repetate, care este numită instabilă. În aceste cazuri, dacă secvenţa se găseşte în interiorul sau vecinătatea unei gene, se produce o alterare a expresiei genei ce conţine secvenţa şi deci o stare de boală.

         În afara expansiunii repetiţiilor trinucleotidice instabile există foarte probabil si expansiuni ale altor tipuri de repetiţii. Astfel, o expansiune a unei repetiţii de 12 nucleotide în gena cistatin B produce epilepsia mioclonică progresivă.

La bolile prin repetiţii trinucleotidice ne vom referi în detaliu în capitolul 11.D dar aici vom preciza că modul lor de transmitere prezintă două caracteristici neobişnuite: există o creştere a riscului de apariţie a bolii sau a severităţii şi precocităţii manifestărilor clinice în succesiunea generaţiilor (anticipaţie); formele cele mai severe se transmit de preferinţă printr-unul din părinţi (“efect parental”).

Expansiunea instabilă a repetiţiilor trinucleotidice este un mecanism nou şi neaşteptat, care ridică în discuţie trei întrebări majore:

§       cum se produce boala prin aceste expansiuni?

§       care este mecansimul instabilităţii şi expansiunii?

§       cum au apărut aceste mutaţii  în populaţiile umane şi, mai ales, cum au putut să se menţină la un nivel atât de ridicat?

a. Mecanismul de producere a bolii prin expansiuni trinucleotidice.

Caracteristica definitorie a mutaţiilor dinamice o constituie instabilitatea lor, exprimată cel mai adesea prin creşterea numărului de copii trinucleotidice[5]. Instabilitatea devine manifestă cu ocazia diviziunilor pe care le realizează celula purtătoare, fie în timpul transmiterii de la părinţi la descendenţi (instabilitate intergeneraţională sau “instabilitate meiotică”), fie prin mitoză, producând variaţii de mărime în ţesuturile unui individ afectat (mozaicism somatic sau “instabilitate mitotică”). Instabilitatea se exprimă  clinic sub formă de boală când este depăşit un anumit prag critic de repetări. Sub pragul critic variaţiile numărului de repetiţii trinucleotidice generează polimorfisme ADN benigne. O nouă traversare a meiozei, de această dată în gonadele bolnavilor, se soldează – cel mai frecvent – cu expansiuni adiţionale care, în generaţia următoare, vor imprima o simptomatologie mai severă şi vor precipita debutul clinic, la o vârstă mai precoce. Acest fenomen, denumit anticipaţie, caracterizează aproape toate bolile prin repetiţii trinucleotidice descrise până în prezent, dar se manifestă şi în alte afecţiuni cu mecanism patogenic neclar.  

Intensitatea de manifestare a bolii la descendenţi este proporţională cu dimensiunile secvenţei amplificate şi depinde uneori de sexul părintelui prin care se face transmiterea: în sindromul X fragil  şi distrofia miotonică boala este mai gravă dacă transmiterea se face de către mamă, în timp ce în boala Huntington gravitatea formei clinice este mai mare când boala este transmisă de către tată. Mecanismul acestui “efect parental” este necunoscut.

Genele ce conţin expansiuni trinucleotidice instabile se împart în două clase majore:

(1).Gene care prezintă expansiuni foarte mari ale unor repetiţii (CGG, CCG, CTG, GAA), localizate în secvenţele necodante ale genei – în promotor, regiunile 5’ şi 3’ transcrise dar netranslate sau în introni (tabelul 6.2, primele trei exemple).  Expansiunea lor masivă blochează transcripţia genei şi produce pierdera funcţiei genei.

Alelele normale  şi stabile au de obicei 5-50 repetiţii; alelele cu mărime intermediară  - între 25-200 repetiţii – sunt nepatogene (atenţie: pragul critic este destul de mare) dar foarte instabile. Creşterea treptată a numărului de repetiţii accentuează instabilitatea şi realizează, în apropierea pragului critic, o premutaţie.  Purtătorii de premutaţii sunt fenotipic normali dar vor avea descendenţi afectaţi deoarece în celulele lor germinale se produce o expansiune bruscă a premutaţiei care, prin depăşirea pragului critic de repetiţii, devine mutaţie completă.

(2). Gene ce prezintă o expansiune moderată a tripletului CAG (ce codifică glutamina) în secvenţele codante (tabelul 6.2, exemplul patru); această expansiune nu modifică transcripţia şi translaţia dar alterează structura şi funcţia proteinei codificate (generând o secvenţă poliglutaminică anormală). Alelele normale şi stabile au 10-30 repetiţii, ele devin (ocazional) patogene la un prag critic foarte îngust[6] şi determină o alterare specifică a anumitor neuroni[7]. Cu cât repetiţia este mai mare cu atât boala debutează la o vârstă mai precoce. Acest mod de acţiune – după cum se vede diferit de primul grup – rămâne enigmatic.

  Prezenţa unui mecanism unic de mutaţie (sau predominant) face ca identificarea mutaţiei prin analiza ADN să fie cel mai bun mijloc de diagnostic exact a fiecăreia dintre bolile prin expansiunea repetiţiilor trinucleotidice.

b. Mecanismul expansiunii repetiţiilor trinucleotidice.

Mecanismul expansiunii nu se cunoaşte exact dar probabil este identic la toate tipurile de repetiţii trinucleotidice. Cel mai probabil expansiunea se produce prin fenomenul de glisare sau derapare replicativă (descris mai sus; figura 6.8), determinat de alinierea greşită şi împerecherea decalată a repetiţiilor trinucleotidice. O dovadă: repetiţiile „întrerupte” prin introducerea unui triplet diferit (de ex., CAT în repetiţia CAG) sunt stabile comparativ cu repetiţiile „omogene”. S-a sugerat că regiunile cu repetiţii trinucleotidice pot forma, dincolo de un anumit prag de lungime,  structuri spaţiale anormale ale ADN (în „ac de păr” sau „triplu helix”) care perturbă replicarea şi favorizează derapajul replicativ.

Există o serie de dovezi care susţin rolul fragmentelor Okazaki în expansiunea repetiţiilor trinucleotidice. Unele repetiţii trinucleotidice (precum CCG în sindromul X fragil sau CAG în distrofia miotonică) prezintă o distribuţie bimodală a instabilităţii, cu o graniţă între modificările minore şi cele majore ale numărului repetiţiilor trinucleotidice care este aproximativ egală cu dimensiunea unui fragment Okazaki. De asemeni, structurile secundare CAG/CTG şi repetiţiile CGG pot inhiba activitatea endonucleazei FEN1 implicată în procesarea fragmentelor Okazaki. Drojdiile mutante pentru Rad27 (echivalentul FEN1) prezintă tendinţa spre instabilitatea numărului secvenţelor repetitive.

Mecanismul de glisare replicativă ar trebui să producă şi contracţii – prin deleţii – alături de expansiuni (vezi figura 6.8) dar acest fenomen este rar şi deloc instabil; nu se ştie încă de ce se produc cu predilecţie mai ales expansiuni. De asemenea nu se ştie dacă modificările repetiţiilor trinucleotidice la transmiterea intergeneraţii se produc în gametogeneză, la fecundarea sau în primele diviziuni din embriogeneză. În sfârşit, trebuie spus că glisarea replicativă a fost implicată şi în fenoemnul de instabilitate a microsateliţilor din anumite cancere dar bolile prin repetiţii trinucleotidice nu se asociază cu un defect din repararea ADN şi nici cu o incidenţă crescută a neoplaziilor.

Există şi date care contrazic rolul replicării ADN în expansiunea repetiţiilor trinucleotidice. Astfel, au fost identificate modele animale pentru boala Huntington la care se constată o creştere marcată a numărului repetiţiilor CAG la nivelul neuronilor din striatum. Aceşti neuroni nu mai suferă diviziuni celulare, ceea ce arată că expansiunea repetiţiilor trinucleotidice a aparut independent de replicare.

c. Originea mutaţiilor prin expansiunea repetiţiilor trinucleotidice.

Se pune firesc întrebarea: cum s-au putut menţine la un nivel de frecvenţă populaţională ridicat două dintre bolile prin repetiţii trinucleotidice – sindromul X fragil (transmitere legată de X) şi distrofia miotonică (DM) (transmitere autosomal dominantă) – care reduc firesc eficacitatea reproductivă (fitness)? Un răspuns „imediat” ar fi: o producţie foarte mare de mutaţii noi. Dar, neaşteptat, s-a descoperit că în cele două boli există un dezechilibru de înlănţuire[8] între markeri polimorfici apropiaţi de genă, sugerând astfel un efect de fondator! Analiza locusului DM relevă că 10% din populaţie are o alelă normală lungă (cu 20-30 CTG) ce constituie rezervorul mutaţiilor recurente, evoluând în mai multe generaţii spre „lungimea patologică”. Aceste alele lungi normale au apărut printr-un  eveniment ancestral unic, fapt ce explică dezechilibrul de înlănţuire observat pentru alelele patologice. Date asemănătoare se cunosc şi despre coreea Huntington: alelele patologice  provin de la un tată sănătos, purtător al unei alele lungi normale (30-35 repetiţii)

 

                1.5 MECANISME  RARE

  

§       Genomul uman conţine un număr mare de secvenţe repetate dispersate, în special secvenţe scurte (300 pb) de tip Alu, din familia Sine, sau secvenţe mai lungi (3-7 kb) din familia Line, derivate din retrotransposoni  (vezi capitolul 2.C.2.2). Unele secvenţe pot fi active şi sunt capabile de transpoziţie prin ARN intermediar, inserându-se aleatoriu în genom; dacă inserţia se face în exoni, atunci se întrerupe secvenţa ce codifică o proteină; dacă inserţia se face în introni poate fi afectată matisarea lor. Astfel, s-au descris cazuri de hemofilie A, distrofie musculară Duchenne, polipoză de colon produse prin inserţia unei repetiţii LINE 1 sau de neurofibromatoză 1 cauzate de inserţia unui element transpozabil activ Alu. Mecanismul de mutageneză inserţională pare, din fericire, puţin activ la om.

§       Rearanjările cromosomice, de tipul  translocaţiilor reciproce echilibrate, care au punctul de ruptură în interiorul unei gene, pot produce inactivarea ei. Acest mecanism este foarte rar dar important pentru localizarea foarte precisă şi apoi clonarea  genei implicate.

 

2. CONSECINŢELE GENOTIPICE ŞI FENOTIPICE ALE MUTAŢIILOR GENICE

 

                Consecinţele mutaţiilor genice asupra genotipului şi expresiei sale fenotipice sunt complexe şi dependente de factori multipli. Analiza este dificilă, datorită volumului mare de informaţii, iar prezentarea lor nu poate fi decât sintetică şi schematică.

               

                2.1. MUTAŢII ÎN GENOMUL NUCLEAR ŞI MITOCONDRIAL

               

Cele mai multe mutaţii genice afectează genomul nuclear şi, din acesta, ADN extragenic, care reprezintă imensa majoritate a genomului. Se produce astfel un foarte amplu polimorfism al ADN, care însă nu are consecinţe fenotipice. În felul acesta marea majoritate a mutaţiilor nu au consecinţe asupra individului şi se poate spune că „soluţia imensităţii ADN extragenic, necodant”  este benefică pentru evoluţie. Din fericire, aceasta nu este unica „soluţie de protecţie” din natură: să ne amintim de existenţa ADN necodant din structura genelor, precum şi de mutaţiile sinonime („silenţioase”) sau de cele conservative (vezi secţiunea B.1.1). Practic, numai anumite alterări în structura şi expresia genică vor fi implicate în producerea unor boli, dar despre acestea vom discuta în secţiunea următoare.

Genomul mitocondrial reprezintă doar circa 1/200.000 din mărimea genomului nuclear. ADNmt se găseşte în mii de copii în fiecarea celulă somatică; dacă se produce o mutaţie într-o singură moleculă de ADNmt se poate presupune că şansa „fixării” ei va fi foarte mică şi deci rata mutaţiilor mitocondriale cu efect patogen va fi foarte joasă. Totuşi, frecvenţa bolilor mitocondriale este suficient de mare pentru a considera genomul mitocondrial ca o ţintă preferată („un punct fierbinte”) a mutaţiilor. Acest paradox se poate explica prin:

§       procentajul foarte mare al regiunilor codante din ADNmt (93% vs 3% în genomul nuclear);

§       rata foarte înaltă a mutaţiilor la nivelul ADNmt, supus unui „bombardament” continuu de către speciile reactive de oxigen (produse de  catena respiratorie din mitocondrii) şi neprotejat de către histone; ADNmt suferă mai multe runde de replicare decât ADN cromosomic iar sistemele de reparare a leziunilor ADNmt sunt reduse şi puţin eficace;

§        rata foarte mare de fixare a mutaţiilor în ADNmt

Deci rata mutaţiilor în ADNmt este foarte mare datorită combinaţiei dintre instabilitatea crescută a ADNmt şi rata înaltă de fixare a mutaţiilor.

               

                2.2 CONSECINŢELE MUTAŢIILOR ASUPRA INFORMAŢIEI ŞI EXPRESIEI GENICE.

 

Consecinţele genotipice ale mutaţiilor genice depind în principal de tipul şi localizarea mutaţiilor în structura genei.

a). Efectul tipului de mutaţie.

Efectul tipului de mutaţie – microleziuni (substituţii, deleţii şi inserţii nucleotidice mici) sau macroleziuni / remanieri genice (deleţii, duplicaţii, inserţii, inversii etc) – asupra informaţiei genice a fost discutat în secţiunea anterioară. Fără a reveni, vom reaminti că substituţiile se produc cel mai frecvent în secvenţele codante determinând, prin mutaţii nesinonime, modificări ale secvenţei de aminoacizi ale proteinelor iar deleţiile şi inserţiile mici (non-multiplu de trei) produc decalarea cadrului de lectură şi o proteină complet anormală. Remanierile genice importante determină o perturbare a expresiei genice afectând transcripţia, procesarea ARNm, translaţia sau stabilitatea proteinelor.

b). Efectul localizării intragenice a mutaţiei.

 Orice componentă din structura genei (vezi 3.B.1) poate fi afectată de mutaţii (figura 6.6). În funcţie de localizarea intragenică vom deosebi trei categorii principale de mutaţii:

§       mutaţii în regiunile codante – determină sinteza unei proteine cu o structură anormală a cărei funcţie va fi de obicei redusă sau abolită, mai rar crescută sau modificată, diferită de funcţia iniţială;

§       mutaţii care afectează  matisarea ARNm precursor sau stabilitatea ARNm matur – produc, în funcţie de mecanism, fie o proteină anormală, fie o modificare a cantităţii de proteină normală sintetizată;

§       mutaţii care afectează dozajul genic (deleţii, duplicaţii) sau reglarea procesului de transcripţie –  determină scăderea sau creşterea sintezei proteice, mai rar o expresie inadecvată ca timp şi spaţiu.

În esenţă, mutaţiile – în diferite regiuni din structura genei – produc fie o modificare a structurii proteinei, fie o  perturbare a diferitelor etape ale expresiei genice (la nivelul transcripţiei, procesării şi maturării ARNm precursor, al translaţiei sau stabilităţii proteinei).

(1).   Transcripţia. Mutaţiile pot afecta transcripţia alterând elemente diferite necesare reglării acestui proces.

§       Secvenţele regiunii promotor (de ex. a genei codante pentru β-globină) pot fi modificate de mutaţii diverse care vor altera legarea factorilor de transcripţie; în acest context vom sublinia că există şi mutaţii ale genelor ce codifică factori de transcripţie, deseori letale sau producând anomalii de dezvoltare;

§       Secvenţele 5’UTR sau 3’UTR, transcrise dar netranslate, din primul şi ultimul exon al genei, pot suferi mutaţii ce modifică rata sintezei proteice. Au fost descrise mutaţii ale secvenţei 5’UTR în  gena pentru factorul IX ce produce hemofilia B Leyden şi în gena FMR1 care determină sindromul X-fragil sau ale secvenţei 3’UTR în gena DM ce produce boala Steinert.

(2).     Maturarea ARN premesager în ARNm. Mutaţiile pot afecta matisarea şi poliadenilarea ARNm precursor (vezi capitolul 4.B.2.b).

§       Alterarea (prin substituţie) a situsurilor de decupare a intronilor[9] – situsul donor (5’-GT) sau acceptor (AG-3’) – face ca excizia să se producă la următorul exon şi astfel se va încorpora în ARNm matur o parte sau întregul intron sau va lipsi un exon[10] (în funcţie de situsul afectat). Ambele situaţii au consecinţe importante asupra expresiei genei (ARNm instabil; polipeptid nefuncţional).

§       Activarea, prin mutaţie, a unui situs criptic de decupare (dintr-un exon sau intron) va antrena o competiţie cu situsurile normale în cursul procesului de maturare a ARNm; aceste mutaţii pot produce o proteină trunchiată cu activitate funcţională nulă sau foarte redusă (în funcţie de exonul afectat) sau vor bloca transcripţia (când se produc în introni)

(3).    Translaţia ARNm în proteină.

§       Mutaţiile codonului iniţiator, mutaţiile cu decalarea cadrului de lectură (frameshift) sau mutaţiile non-sens determină de regulă absenţa formării proteinei codificată de gena ce a fost modificată sau producerea unei proteine trunchiate.

§       Mutaţiile cu sens greşit modifică semnificaţia unui codon şi consecinţele lor sunt variabile după natura schimbării şi amplasarea în proteină a aminoacidului modificat. Mutaţiile nesinonime pot afecta stabilitatea proteinei, localizarea intracelulară, maturarea proteinei, asamblarea ei în structuri multimerice, interacţiunile cu liganzii sau alte proteine, situsul funcţional pentru activitatea enzimatică etc). Mutaţiile sinonime (sau neutre) sunt însă fără efect (exceptând situaţiile de activare a unui situs criptic de matisare).

§       Mutaţiile în codonul terminator vor duce la încorporarea adiţională de aminoacizi în proteină, care va deveni instabilă.

               

2.3. EFECTUL FENOTIPIC AL MUTAŢIILOR PATOGENE

 

                Alterând funcţia unei proteine, mutaţiile pot avea consecinţe patologice majore, fiind astăzi unanim recunoscute ca o cauză importantă de boală sau predispoziţie la îmbolnăvire.

Efectul fenotipic al mutaţiilor patogene depinde de mai mulţi factori:

§       efectul mutaţiilor asupra funcţiei proteinei; în esenţă este vorba de pierderea şi câştigul de funcţie, dar aceste aspecte sunt mai complexe şi vor fi nuanţate şi detaliate mai jos;

§       tipul şi funcţia proteinei: enzimă, proteină structurală, receptor membranar, canal ionic etc;

§       gradul  în care fenotipul anormal va fi exprimat la heterozigoţi; în bolile recesive prezenţa unei alele normale la heterozigoţii N/a poate fi suficientă pentru menţinerea unei stări normale; în unele boli dominante heterozigoţii A/n au un fenotip mai puţin modificat comparativ cu homozigoţii A/A;

§       gradul în care expresia genei mutante va fi influenţată de alte gene modificatoare care generează un fond genetic diferit la persoane diferite;

§       natura celulelor (germinale sau somatice) şi proporţia  de celule (în mozaicurile somatice) care au gena mutantă; mutaţiile moştenite de la părinţi, prin gameţi, sunt prezente în toate celulele unui individ; mutaţiile somatice vor avea efecte dependente de momentul ontogenetic în care se produc şi, în consecinţă, de proporţia celulelor ce formează clona anormală;

§       originea parentală a mutaţiilor, în cazul genelor cu amprentare parentală.

Asupra unora din aceşti factori, ce influenţează în esenţă ereditatea monogenică, ne-am referit în capitolul anterior şi vom reveni cu detalii şi exemple în capitolul 11.A. Considerăm totuşi utile pentru înţelegerea efectelor mutaţiilor câteva precizări sintetice despre efectul mutaţiilor asupra funcţiei proteinei.

Mutaţiile patogene, cauzatoare de boală, pot avea – în funcţie de tipul şi mecanismul de acţiune – patru tipuri de efecte asupra funcţiei proteinei codificată de gena care a suferit mutaţia.

(1)     Pierderea funcţiei. Numeroase tipuri de mutaţii pot produce o pierdere totală sau parţială a activităţii normale a genei şi deci a expresiei proteinei. Aceste mutaţii  sunt la originea majorităţii bolilor cu transmitere recesivă, care se manifestă la homozigoţi sau heterozigoţi compuşi (ambele gene alele sunt modificate); ele se pot găsi şi în unele boli cu transmitere dominantă prin haploinsuficienţă, cum ar fi hipercolesterolemia familială, în care formele heterozigote sunt mult mai puţin severe decât cele homozigote; totuşi pierdera a 50% din activitatea genei este suficientă pentru producerea bolii.

(2)     Câştigul de funcţie. Mutaţiile asociate cu un câştig de funcţie a proteinei sunt mult mai rare; ele pot acţiona fie prin creşterea nivelului de expresie a proteinei (de exemplu, prin creşterea dozajului genic), fie prin creşterea abilităţii proteinei de a-şi efectua funcţia normală proteinei (de exemplu, activarea permanentă a unui receptor, în absenţa ligandului).

(3)     Achiziţia unor proprietăţi noi de către proteina mutantă, prin mecanisme diverse:

-          modificarea proprietăţilor structurale ale proteinei ce tinde să polimerizeze sau să se agrege (mutaţii ale genei β-globinei în sicklemie sau mutaţii ale genelor asociate cu amiloidoza);

-          achiziţia unei funcţii noi (varianta α1-antitripsină Pittsburg nu mai acţionează ca o anti-elastază ci ca un puternic inhibitor al factorilor de coagulare);

-          producţia unei proteine toxice (gena ce codifică precursorul peptidului pentru β-amiloid şi produce forme precoce de boală Alzheimer);

-          participarea polipeptidului mutant la formarea unor complexe multimerice, alături de proteine normale, face ca întregul complex să fie anormal sau nefuncţional; acest efect a fost numit “dominant negativ” (de exemplu, genele COL1A1 sau COL1A2 ale colagenului).

(4)     Expresia inadecvată a genei fie ca timp (expresie heterocronică), fie ca loc (expresie ectopică), fie ambele. În această categorie se încadrează persistenţa ereditară a hemoglobinei fetale sau expresia inadecvată a oncogenelor, în celule în care aceste gene nu sunt normal exprimate.

 

2.4. CORELAŢII DINTRE GENOTIP ŞI FENOTIP

 

                Studiul mutaţiilor patogenice, cauzatoare de boală, a dus la o mai bună înţelegere a relaţiilor dintre genotip şi fenotip în bolile genetice. Desigur, relaţia clasică „o genă → un caracter (boală)”  ce stă la baza eredităţii monogenice ramâne valabilă pentru multe boli dar aceasta nu este singura corelaţie posibilă între genotip şi fenotip. Cu riscul de a reveni asupra unor aspecte discutate, dar pentru a asigura o înţelegere completă a problemei, vom preciza aceste posibile corelaţii.

O genă → o boală. Multe afecţiuni monogenice sunt produse de mutaţia unei anumite gene. Totul pare simplu şi clar. În realitate, posibilităţile actuale de analiză a genei şi, implicit, de identificare a mutaţiilor au arătat că lucrurile nu sunt simple iar problema corelaţiei genotip-fenotip este destul de complexă. În unele boli (sicklemie, acondroplazie, boala Huntington, ş.a) mutaţia este unică, deoarece produce maladia printr-o modificare funcţională foarte precisă a proteinei sau a expresiei genei. În alte afecţiuni o anumită mutaţie este preponderentă, datorită unui „punct fierbinte” din structura genei ce determină recurenţa mutaţiei (inversia în hemofilia A, deleţia în amiotrofia spinală, expansiunea trinucleotidică în sindromul X-fragil etc). În numeroasele boli produse prin pierderea funcţiei unei proteine heterogenitatea mutaţiilor din genă este aproape regula (de exemplu, mai mult de 130 de mutaţii în β-talasemie şi peste 600 în fibroza chistică). Spectrul mutaţiilor reflectă sensibilitatea genei la diferite mecanisme mutaţionale iar corelaţia dintre anumite mutaţii şi anumite manifestări clinice ramâne a fi definită în viitor.

O genă → mai multe boli. Există numeroase exemple care demonstraeză că mutaţii produse într-o singură genă determină boli distincte, diferite. După un studiu a lui Pearson (1996) pe 750 de gene indexate în OMIM, 100 produceau prin mutaţii mai multe boli (2-7) diferite (în total 248). Cităm cîteva exemple:

§       mutaţiile genei pentru beta-globină (pe cromosomul 11pter) produc sicklemia (AR), β-talasemia (AR), methemoglobinopatia (AD) şi o hemoglobina instabilă (AD);

§       mutaţii în gena RET (11q12) (ce codifică un receptor tirozinkinazic, implicat în migrarea celulelor din creasta neurală) produc boala Hirschprung şi trei forme de cancer ereditar al glandelor tiroidă şi suprarenală (neoplaziile endocrine multiple MEN2A şi  MEN2B  precum şi cancer medular tiroidian); un al treilea grup de mutaţii în gena RET produc ambele boli la acelaşi individ;

§       gena LICAM (pe cromosomul Xq28)  prezintă mutaţii în hidrocefalia prin stenoza apeductului Sylvius, sindromul MASA (mental retardation, aphasia, shuffing gait, adducted thumbs = retard mintal, afazie, mers "târşâit" – spastic şi adducţia policelor) şi paraplegia spastică 1;

§       gena COL1A2 este implicată în patru forme diferite clinic de osteogenesis imperfecta şi sindromul Ehlers-Danlos tipul VII B;

§       mutaţiile genei FGFR2 (receptorul factorului de creştere fibroblastică 2) produc trei sindroame diferite cu craniostenoză, numite Crouzon, Pfeiffer şi Jackson-Wiess.

Mai multe gene → o boală. Este vorba de heterogenitatea nonalelică, de locus, în care mutaţii în gene diferite se manifestă fenotipic identic sau foarte asemănător; în capitolul 4.A.5 şi tabelul 4.1 am discutat mai multe exemple, precum şi importanţa practică a acestui fenomen relativ frecvent.

Vom mai adăuga un exemplu ilustrativ: boala Hirschprung („megacolonul congenital”) – caracterizată prin dezvoltare insuficientă a ganglionilor colonici, care produce secundar hipomotilitatea şi distensia colonului, constipaţie severă cronică – se poate prezenta fie ca o formă izolată, fie ca o componentă a unor sindroame plurimalformative (sindromul Down, sindromul Waardenburg). Formele izolate au fost considerate mult timp ca fiind un exemplu de ereditate multifactorială. Studii recente au arătat că cel puţin jumătate din cazurile familiale şi 20% din cazurile sporadice de boală Hirschprung sunt determinate de o mutaţie într-una din următoarele cinci gene diferite: gena RET („Rearranged during Transfection), care codifică un receptor pentru tirozin-kinaze, ligandul său GDNF, gena pentru receptorul B al endotelinelor (EDNRB), gena pentru endotelina 3 (EDN3) şi gena pentru enzima de conversie a endotelinei (ECE1). Vom mai adăuga faptul că în sindromul Waardenburg (pete hipopigmentate ale pielii sau meşă albă frontală, surditate neurosensorială, megacolon congenital)  intervine o genă ce codifică factorul de transcripţie SOX10.

Ereditatea digenică: două gene pentru un fenotip. Boala apare prin mutaţii concomitente în două gene nealele; de exemplu, o formă de retinită pigmentară este produsă numai dacă se produc concomitent mutaţii în gena RDS (pe cromosomul 6p)şi în gena ROM (pe cromosomul 11q).

O mutaţie → nu determină totdeauna acelaşi fenotip. Fenotipul produs de o mutaţie poate fi influenţat de acţiunea altor gene (de exemplu o aceiaşi mutaţie – C342R – în gena FGFR2 poate produce sindromul Crouzon sau sindromul Pfeiffer) sau de factori de mediu (de exemplu, mutaţia în gena PAH  poate produce prin deficienţa fenilalanin hidroxilazei fenilcetonuria cu retard mintal sever, sau ramâne fără efect dacă bolnavii sunt depistaţi la naştere şi primesc o dietă fără fenilalanină).

                Mutaţii în aceeaşi genă → forme dominante sau recesive ale bolii. Deficienţa în factorul von Willebrand este o tulburare a coagulării sângelui relativ frecventă (vezi capitolul 11.E) Unele mutaţii (deleţii, nonsens, frameshift) în gena VWF (pe cromosomul 12p) produc o formă de boală cu transmitere recesiv autosomală iar alte mutaţii (mai ales substituţii cu sens greşit) determină forme dominante

 

                3. CAUZELE ŞI FRECVENŢA MUTAŢIILOR GENICE

 

Mutaţiile genice se pot produce spontan, natural, cel mai frecvent prin erori accidentale în cursul replicării, sau pot fi induse de agenţi exogeni sau endogeni, numiţi mutageni. Aceste cauze – spontane sau induse – generează multiple şi frecvente leziuni ale ADN, care au un potenţial nociv major asupra informaţiei ereditare.

      O clasificare simplă a diverselor tipuri de leziuni ale ADN permite gruparea lor în trei mari categorii:

§       Alterări ale bazelor purinice sau pirimidinice: dezaminări spontane, metilări, adiţii variate, substituţii sau pierderea lor şi crearea de situsuri abazice ;

§       Formarea de punţi intra- sau intercatenare (prin agenţi intercalanţi);

§       Rupturi simple, monocatenare, şi bicatenare

Din fericire există în organism mecanisme de reparare eficace care reduc substanţial efectul defavorabil al mutaţiilor.

 

                3.1. MUTAŢII  SPONTANE

 

                Schematic, se pot deosebi două mecanisme de generare  a mutaţiilor spontane

(1). Cea mai importantă sursă de leziuni ADN o reprezintă însuşi procesul de replicare. În cursul replicării semiconservative (vezi 5.A.3.2) fiecare catenă a ADN „parental” serveşte ca matriţă pentru sinteza unei noi catene; acest proces, efectuat de polimeraze, implică recunoaşterea unei baze din catena matriţă şi adăugarea complementară a unui nucleotid la capătul 3’ al catenei ce se sintetizează. ADN polimeraza δ catalizează împerecherea corectă a A cu T şu G cu C, făcând rareori erori. Şi totuşi, datorită unui fenomen de tautomerie (ce implică deplasarea unui atom de hidrogen din nucleotid), acestea pot forma structuri alternative care fac ca bazele să se împerecheze greşit (“mismatch”). ADN polimerazele corectează în mare măsură aceste erori. Acestea  sunt mai rare în cazul ADN polimerazei delta, principala polimeraza implicată în replicarea ADN, dar relativ frecvente în cazul altor polimeraze. Pe ansamblu, erorile care rezultă în urma procesului de replicare au o frecvenţă de aproximativ 50.000/genom/zi. Dar organismul uman posedă alte sisteme de reparare care determină ca rata erorilor de împerechere  apărute în cursul unei runde de replicare să fie extrem de redusă, de circa o încorporare greşită la 109 – 1010 nucleotide.

(2). Există leziuni care pot să apară spontan, în condiţii fiziologice, în absenţa replicării. De exemplu, hidroliza reziduurilor nucleotidice  poate să conducă la situsuri abazice; apariţia lor poate fi favorizată de temperaturi crescute  şi acidifierea mediului celular. Dezaminarea spontană a citozinei, adeninei, guaninei sau 5-metilcitozinei poate conduce la formarea uracilului, hipoxantinei, xantinei şi, respectiv, timinei.

                3.2. MUTAŢIILE INDUSE

                Mutaţiile induse sunt determinate de agenţi mutageni externi sau interni, fizici sau chimici.

(1). Factorii de mediu extern precum radiaţiile ultraviolete (UV) – componentă a radiaţiei solare,  radiaţiile ionizante şi numeroşi agenţi chimici genotoxici pot cauza diverse alterări în structura ADN (tabelul 6.3) care, lăsate nereparate, pot conduce la apariţia mutaţiilor. Pe primul loc ca frecvenţă în această categorie se află radiaţiile ultraviolete, ce produc dimeri pirimidinici. Din punctul de vedere al consecinţelor, fumul de ţigară este însă cel mai important agent mutagen exogen, acesta fiind responsabil de producerea mai multor decese prin cancer decât orice alt agent exogen cunoscut. Hidrocarburi policiclice se găsesc însă şi în produşii de combustie; lor li se adaugă agenţi alchilanţi/metilanţi ce poluează atmosfera, gudroanele de ulei, medicamente antitumorale, diverse minerale sau metale. Radiaţiile ionizante (X, gama) induc în special rupturi mono- sau bicatenare ale ADN. La om, radiaţiile ionizante – din surse naturale, profesionale, medicale sau accidentale – au probabil consecinţe genetice mici (caseta 6.4) (datorită eficacităţii mecanismelor de reparare a leziunilor) reprezentate cel mai adesea sub formă de mutaţii recesive, care se vor manifesta numai dacă se întâlnesc doi heterozigoţi cu o mutaţie identică. Organismele internaţionale au definit o limită arbitrară de siguranţă – mai mică decât cea care ar produce un efect semnificativ asupra frecvenţei mutaţiilor dăunătoare din populaţie – recomandând ca expunerea profesională să nu depăşească 50 mSv pe an .

CASETA 6.4

Radiaţiile ionizante

 

Radiaţiile ionizante includ unde electromagnetice cu lungime de undă foarte mică (razele gama şi razele-X) precum şi particule cu energie înaltă (particule alfa, beta şi neutroni). Razele-X, razele gama şi neutronii au mare putere de pătrundere comparativ cu particulele alfa şi beta (numai câţiva milimetri). Cantitatea de radiaţii primită pe ţesut iradiat se numeşte doză de radiaţii şi este măsurată în doză absorbită de radiaţii sau rad (radiation absorbed dose). Oamenii pot fi expuşi la un amestec de radiaţii şi atunci se foloseşte o unitate convenţională rem (roentgen equivalent for man) pentru a măsura orice radiaţie în termeni de raze-X. Un rem de radiaţie este acea doză absorbită care produce într-un ţesut dat acelaţi efect biologic ca 1 rad de  raze-X. Un milirem (mmrem) este a mia parte dintr-un rem.100 rem este echivalent cu 1 sievert (Sv) iar 100 razi este echivalent cu 1 gray (Gy); pentru practică, sievert şi gray sunt aproximativ egale.

Potrivit unei concepţii mai vechi, bazată pe studii experimental, orice iradiere produce mutaţii (nu există prag sub care iradierea să nu aibe efect), numărul de mutaţii produse de radiaţii creşte proporţional cu doza, efectele genetice sunt cumulative. Studii recente par să infirme conceptul lipsei de prag, relevând că dozele mici stimulează activitatea mecanismelor reparării ADN.

Sursele de radiaţii  la care este expus omul sunt naturale (radiaţii cosmice, materiale radioactive) şi artificiale (radiologie diagnostică sau terapeutică, expunere profesională, expunere accidentală) iar doza medie de radiaţii primită pe gonade, din diferite surse, este apreciată (Clarke şi Southwood, 1989) la 2,4 mSv pe an şi 72 mSv pentru 30 de ani (perioada reproductivă)[11].

La om efectele genetice ale radiaţiilor sunt greu de studiat deoarece ele nu sunt manifeste la generaţia expusă ci numai la generaţiile următoare şi aceasta în funcţie de tipul de mutaţie: dominant, recesiv sau legat de X. Studiile ample efectuate de către Neel şi Schull la supravieţuitorii bombardamentelor atomice din Japonia au arătat că nu există diferenţe semnificative ale nou-născuţilor morţi, malformaţiilor congenitale, deceselor neonatale, sex ratio (pentru mutaţii letale legate de X), cancere îniante de vârsta de 20 de ani – la urmaşii părinţilor expuşi (la o doză de 30-60 remi) comparativ cu descendenţii unui lot martor neexpus la radiaţii atomice. Rezultate similare au fost obţinute şi prin analiza efectelor iradierii medicale.  În ceea ce priveşte iradierea profesională, mai ales în centralele nucleare, s-a descris o creştere semnificativă a numărului de copii cu leucemie din taţi ce lucrează în aceste unităţi, posibil prin inducerea de mutaţii în celulele lor germinale. Alte cercetări nu au reuşit, totuşi, să ateste efectele leucemogene ale iradierii paterne. Şi datele privind iradierea accidentală sunt contradictorii. Un studiu al persoanelor expuse la radiaţii după accidentul de la centrala nucleară de la Cernobîl indică o creştere de două ori a ratei mutaţiilor germinale. Dar este dificil să se compare aceste date cu rezultatele studiilor Japoneze deoarece tipul de radiaţii este oarecum diferit, lotul de la Cernobîl este mic (79 de familii) iar grupul martor era din populaţia britanică. În concluzie, încercările de a demonstra că radiaţiile produc alterări genetice la om nu au fost foarte convingătoare. Aceasta nu înseamnă că radiaţiile ionizante nu au consecinţe genetice ci numai ca acestea sunt probabil mici (mecanismele de reparare a leziunilor sunt destul de eficace) si cel mai adesea sub formă de mutaţii recesive, care se vor manifesta numai dacă se întâlnesc doi heterozigoţi cu o mutaţie identică.

Organismele internaţionale au definit o doză permisivă de radiaţii. Aceasta este o limită arbitrară de siguranţă şi este foarte probabil mai mică decât cea care ar produce un efect semnificativ asupra frecvenţei mutaţiilor dăunătoare din populaţie. S-a recomandat ca expunerea profesională să nu depăşească 50 mSv pe an, dar unele ţări au scăzut această doză la 15 mSv. Pentru a avea o imagine clară asupra acestei doze (prin comparaţie cu iradierea medicală sau cosmică) trebuie spus că 1 mSv este echivalentul dozei primite la 50 de radiografii toracice şi în 100 de zboruri de la Bucureşti la Paris. Cu toate acestea, este obligatoriu să se evite orice expunere nenecesară la radiaţii, în special pe gonade sau asupra fătului, şi să se asigure obligatoriu o protecţie maximă.

 

(2). Alte leziuni sunt produse de către diferite agresiuni endogene  cum ar fi  speciile reactive de oxigen (2-20.000 leziuni/genom/zi), o serie de molecule reactive mici (precum S-adenozil metionina: 600 leziuni/genom/zi) şi mai ales produşii de peroxidare ai lipidelor (malondialdehida, acroleina şi crotonaldehida care sunt metabolizate rapid către epoxizi şi pot genera apoi alterări ale bazelor ADN). Organismul poseda un sistem antioxidant (superoxid dismutaza, catalaza, glutation peroxidaza etc.) care încearcă să minimizeze aceste efecte. Atunci când capacitatea acestui sistem este depasită, aceşti agenţi induc modificări ale bazelor ADN şi rupturi monocatenare prin alterarea deoxiribozelor.

 

Tabelul 6.3 Tipuri de leziuni ADN şi agenţii etiologici ai acestora

 

Tipul de leziune ADN

Agentul etiologic

Erori de împerechere

Erori ale replicării

Situsuri abazice

Erori ale replicării, spontan

Deaminări

Spontan

Alchilări

Agenţi metilanţi (S-adenozil metionina)

Baze oxidate sau hidroxilate

UV-A, radicali ai oxigenului, radiaţii X, produşi ai peroxidării lipidelor

Dimeri pirimidinici

UV-B (> 320 nm)

Adiţia unor radicali chimici

Carcinogeni (atmosferici, alimentari, fum de ţigară), citostatice

Legături încrucişate intracatenare sau cu proteinele

Carcinogeni, citostatice

Legături încrucişate intercatenare

Mitomicina C, cisplatinul

Rupturi monocatenare

Radiaţii X, inhibitori ai topoizomerazei I, radicali ai oxigenului

Rupturi bicatenare

Radiaţii gama, inhibitori ai topoizomerazei II

 

                3.3. frecvenŢa mutaŢiilor genice.

 

                Rata mutaţiilor unei gene se exprimă de obicei ca număr de mutaţii noi per locus per generaţie şi se evaluează prin determinarea incidenţei unor cazuri sporadice, noi, a unor boli autosomal dominante (cu penetranţă completă) sau recesive legate de X, care au o expresie clinică uşor de recunoscut (de exemplu, acondroplazia, aniridia, hemofilia, distrofia musculară Duchenne ş.a). Determinările pentru diferite afecţiuni au dat valori ale ratelor mutaţiilor germinale cuprinse între 10-4 şi 10-7 mutaţii per locus / per generaţie, cu o frecvenţă medie de 1×10-6. Aceasta înseamnă că cel puţin una din 20 de persoane a primit de la unul din părinţi o genă mutantă nouă.

Mutaţiile noi se pot produce în spermatogeneză sau ovogeneză, în cursul diviziunilor mitotice sau meiotice ale celulelor germinale. Există însă diferenţe importante între cele două sexe privind timpul de producere şi numărul de diviziuni celulare pe care le suferă celulele sexuale.

În ovogeneză, fiecare gamet este rezultatul a 22 de diviziuni mitotice şi unei diviziuni meiotice (23 de diviziuni) ce se produc în cursul vieţii fetale; după cum ştim deja (vezi capitolul 5.C.2) meioza I se opreşte înainte de naştere, rămâne astfel „suspendată” un timp îndelungat şi este reluată numai după ovulaţie. Cu cât ovocitele rămân mai multă vreme în meioza I (şi deci vârsta reproductivă maternă este mai mare) cu atât mai mult creşte riscul nedisjuncţiei meiotice. În spermatogeneză, producţia de gameţi se face până la vârste avansate şi fiecare spermatozoid rezultă, în medie, după 200 de diviziuni iar acest număr creşte cu vârsta. Explicaţie: spermatogoniile suşă se formează până la pubertate, prin circa 30 de mitoze; apoi sunt necesare 5 diviziuni pentru fiecare ciclu de spermiogeneză, care durează 16 zile (deci 23 cicluri pe an); numărul de diviziuni pentru formarea unui spermatozoid se calculează după formula următoare: 30+23n+5, în care n= vârsta în ani–15 (vârsta pubertăţii). La o frecvenţă de 10–10 erori de replicare per genom per diviziune fiecare spermatozoid al adultului va conţine câteva sute de mutaţii noi produse prin acest mecanism. Deşi marea lor majoritate nu vor avea efecte fenotipice aparente se estimează că o mică proporţie de spermatozoizi (circa 1 din 10) vor avea o mutaţie patogenă.

Rezultă, logic, că frecvenţa neomutaţiilor paterne produse prin erori de replicare a ADN ar trebui să fie mai mare decât a neomutaţiilor materne şi să crească odată cu vârsta tatălui, fapt observat în anumite boli, ca neurofibromatoza, acondroplazia sau hemofilia B (la bunicul matern al bolnavului). Acest fenomen este amplificat de faptul că metilarea citozinei în dimerul CpG este mai frecventă în celulele germinale masculine, determinând transversiile de tip C→T sau G→A.

Astfel, mutaţiile FGFR2 (receptorul factorului de creştere fibroblastică de tip 2) – responsabile de sindromul Apert (o craniostenoză asociată cu polisindactilie) – sunt toate de origine paternă. Mai mult, unele remanieri genice (inversia genei ce codifică factorul VII al coagulării sau deleţia/duplicaţia genei PMP22, discutate mai sus) se produc, din motive necunoscute, exclusiv în celulele germinale masculine.

                Diferenţele de sex în producerea unor mutaţii se observă pregnant şi în unele boli prin expansiunea repetiţiilor trinucleotidice. Astfel, expansiunea amplă a repetiţiei CAG, ce produce formele juvenile de boală Huntingon, este în general de origine paternă. Dar expansiunea masivă a repetiţiei CGG în sindromul X fragil se produce aproape întotdeauna în timpul gametogenezei feminine. Aceste diferenţe pot exprima nu  numai diferenţele fundamentale dintre ovogenză şi spermatogeneză ci şi o selecţie contra gameţilor ce poartă expansiunea repetiţiei.

                Multe mutaţii se produc, firesc, şi în celulele somatice care efectuează un număr mare de replicări şi diviziuni. Un organism uman adult are circa 1014 celule derivate din zigot prin 1015 diviziuni celulare; la o frecvenţă de 10–10 erori de replicare per genom şi per diviziune rezultă mii de mutaţii noi în genomul fiecărei celule. Dar consecinţele lor fenotipice depind de natura mutaţiei, gena alterată şi ţesutul implicat. Ele se întâlnesc frecvent în procesul de cancerogeneză şi constituie, foarte probabil, una din cauzele heterogenităţii expresiei clinică a unor boli ereditare. Mozaicurile somatice ar putea produce boli genetice numai dacă se produc precoce, în cursul dezvoltării embrionare. Cert este că mutaţiile somatice (non germinale) nu se transmit generaţiilor viitoare.

 

4. MECANISMELE REPARĂRII LEZIUNILOR ADN.

 

Genomul uman suferă numeroase şi variate leziuni – spontane sau induse de agenţi externi sau interni. Totuşi rata mutaţiilor este menţinută la un nivel scăzut prin intervenţia unor sisteme de recunoaştere a leziunilor ADN şi reparare enzimatică, care realizează fie o restituţie fidelă a structurii iniţiale fie o reparare parţială, cu defect. Acţiunea acestor sisteme este corelată cu mecanismele care coordonează progresia prin ciclul celular, tolerarea unor leziuni sau apoptoza. Nici unul dintre mecanismele de reparare ale ADN nu are o eficienţă absolută dar, în general, performanţa lor este ridicată. Existenţa unor boli umane asociate cu defecte în repararea ADN, multe din ele având o creştere a susceptibilităţii la cancer, demonstrează importanţa acestui proces de “control al calităţii ADN”.

 

4.1. MECANISMELE DE REPARARE ALE ADN NUCLEAR .

 

a). Repararea erorilor de împerechere din cursul replicării ADN.

În momentul în care cele două catene ADN sunt separate, nucleotidele activate se aranjează "spontan" şi pe bază de complementaritate pe întreaga porţiune a matriţei de ADN astfel expusă. Stoichiometria reacţiei de poziţionare pe bază de complementaritate permite împerecheri greşite (în special G-T) cu o probabilitate de 1 la 10.000. În plus, replicarea secvenţelor repetitive ale ADN se însoţeşte relativ frecvent de fenomenul de “alunecare (glisare)” (slippage) a ADN-polimerazei, ceea ce conduce la formarea unor bucle de către una din catene cu alungirea (inserţie) sau scurtarea (deleţia) secvenţei repetitive (vezi figura 6.8). Rata mutaţiilor este, însă, mult mai mică datorită  intervenţiei unor mecanisme care asigură fidelitatea replicării şi păstrarea informaţiei ereditare.

Un prim mecanism implică ADN polimerazele care nu catalizează încorporarea pasivă a oricărui nucleotid care este deja legat prin punţi de hidrogen la catena matriţă, ci discriminează activ împotriva unor împerecheri greşite, acestea producând distorsiuni a dublului-helix ADN. Distorsiunile acţionează ca semnal pentru îndepărtare bazei inserate greşit. Mecansimul creşte acurateţea replicării de aproximativ 100 de ori, reducând rata aşteptată a erorilor de la 10-4 la aproximativ 10-6.

Un alt mecanism major răspunzător pentru acurateţea replicării ADN este activitatea de autocorecţie (sau editare de la proofreading) a ADN polimerazelor. Ca un veritabil "editor", ADN polimerazele verifică dacă ultimul nucleotid plasat la capătul 3'OH al catenei de ADN este "scris corect", deci dacă nu există o greşeală de împerechere. In cazul unei astfel de erori ele pot să-l excizeze (datorită capacităţii exonucleazice 3' – 5' pe care o posedă) şi să-l înlocuiască cu nucleotidul corespunzător. O astfel de  activitate, demonstrată pentru ADN polimerazele delta si epsilon, permite creşterea acurateţei replicării ADN de circa 100-1000 ori.

În sfârşit, puţinele erori de împerechere care apar totuşi în ciuda intervenţiei mecanismelor mai sus amintite vor fi ţinta unor mecanisme de reparare a erorilor de împerechere (MMR de la mismatch repair) ce intervin după replicare.

Sistemul MMR a fost descris iniţial la E.coli cu fenotipul mutator (mut), ce determină o creştere a ratei mutaţiilor spontane pentru toţi locii din genomul bacteriei. Sistemul implică intervenţia unor proteine speciale (proteine mutator): Mut S, Mut L şi Mut H – ce formează aşa numitul sistem de reparare “direcţionat metil”. Denumirea derivă de la mecanismul de identificarea a catenei care conţine nucleotidul împerecheat greşit. Această funcţie pare a fi asigurată de diferenţa în statusul de metilare care există între catena nou sintetizată (nemetilată)[12] şi catena matriţă (metilată). În esenţă, împerecherea greşită produce o distorsiune a catenei nou sintetizate, nemetilată, recunoscută de proteina Mut S care se fixează la catenă şi „recrutează” proteinele Mut L (care stabilizează complexul), Mut H (cu acţiune endonucleazică) şi o helicază (Mut U, care desface duplexul ADN). Mut H va cliva catena de ADN şi fragmentul de circa 100 pb va fi îndepărtat de o exonuclează. Golul rezultat va fi reparat de către ADN polimeraza, folosind secvenţa de baze a matriţei. Pasul final este realizarea legăturii fosfodiester de către ADN ligază.

                La om au fost identificate genele care codifică proteinele MSH 2, MSH3 şi GTBP (sau MSH6) – omologe cu Mut S – precum şi proteinele MLH1, PMS1 şi PMS2 –  omologe cu Mut L. Nucleotidele împerecheate greşit  sunt identificate prin intermediul a două complexe: MSH2/MSH6 (GTBP) care recunosc în special erorile de împerechere şi MSH2/MSH3 care recunosc preferenţial micile inserţii/deleţii. După recunoaşterea erorii de împerechere, intervin complexele heterodimerice MLH1/PMS2 şi  MLH1/PMS1 ce interacţionează cu complexele legate anterior (figura 6.18). În continuare, procesul de reparare presupune secţionarea şi degradarea exonucleazică a unui fragment ADN cu o lungime de peste 1-2 kb (ce conţine erorile de replicare), urmată de refacerea secvenţei normale. Pentru aceste acţiuni, mecanismul de reparare utilizează o serie de factori comuni altor sisteme de reparare (ADN-polimeraza δ, RPA, PCNA, factorul de replicare C (RFC), exonucleaza 1, FEN1 şi exonucleazele asociate ADN-polimerazelor δ şi ε).

Mutaţiile genelor implicate în calea MMR au drept consecinţă o boală genetică, relativ frecventă, numită cancerul colorectal nonpolipozic ereditar (HNPCC), responsabilă de apariţia a circa 5% din toate cazurile de cancer colorectal; boala se asociază un risc relativ crescut pentru dezvoltarea unor neoplazii maligne cu alte localizări.

Există câteva caracteristici ale neoplasmelor colorectale care apar în cadrul HNPCC: 70% sunt localizate proximal de flexura splenică, există un exces de cancere mucinoase sau cu infiltraţie limfocitară iar evoluţia pare a fi mai bună. Markerul principal al celulelor cu HNPCC este  instabilitatea microsateliţilor (secvenţe di-, tri- sau tetranucleotidice înalt repetitive, dispersate în genom). Circa 60-70% din cazurile de HNPCC sunt determinate de mutaţii ale genelor MLH1 şi MSH2; un număr redus de cazuri sunt asociate cu mutaţii ale genelor PMS1, PMS2 şi MSH6.

                b). Repararea bazelor modificate sau alterate după replicare

                În afara erorilor ce se produc în timpul replicării, o altă sursă de mutaţii este modificarea chimică sau alterarea bazelor azotate după replicare. Leziunile ADN produse de agenţi endogeni sunt îndepărtate de obicei prin mecanismul de excizie a bazelor (BER) modificate şi mai rar prin reparare directă monoenzimatică (MGMT). Agenţii mutageni exogeni care produc distorsiunea dublului helix prin legături încrucişate intra- sau intercatenare; aceste alterări sunt îndepărtate prin excizia nucleotidelor (NER).

Mecanismele BER, NER şi chiar a MMR sunt variante ale unui mecanism general de reparare prin excizie-resinteză, ce diferă prin ţinta lor, modul de recunoaştere a leziunii şi moleculele efectoare. Acest mecanism se realizează în mai multe etape (figura 6.19):

§       recunoaşterea situsului lezat (bază sau nucleotid), prin acţiunea unor enzime specifice;

§       desfacerea dublului helix, de către o helicază;

§       excizia fragmentului de ADN alterat şi a unui segment învecinat  leziunii, prin intervenţia unor endonucleaze;

§        îndepărtarea şi degradarea fragmnetului, de către exonucleaze;

§       resinteza componentelor breşei/lacunei (folosind ca matriţă catena de ADN complementară) prin acţiunea unor ADN polimeraze;

§        realizarea, de către o ADN ligază, a legăturii fosfodiester între fragmentul de ADN neosintetizat şi capetele libere ale catenei de ADN.

(1). Repararea prin excizia bazei (base excision repair- BER). O bază modificată chimic (frecvent prin dezaminare spontană) este îndepărtată prin intermediul unor ADN-glicozilaze[13] care clivează legătura glicozil dintre baza azotată şi deoxiriboză. Se creează astfel un situs abazic care este recunoscut de către endonucleaza APE1 (apurinic/ apyrimidinic endonuclease 1), enzimă cu rol cheie în calea de reparare BER la om; această enzimă clivează catena ADN  pe flancul 5’ al situsului abazic. Apoi intervine polimeraza β (figura 6.20) care îndepărtează reziduul 5’-deoxiribozo-fosfat (dRp), inseră nucleotidul corespunzător catenei matriţă şi recrutează complexul ligază 3 – XRCC1, care va reface continuitatea catenei.

În unele cazuri reziduul 5’-deoxiribozofosfat rezistă la acţiunea polimerazei β, fiind necesară o cale alternativă, cu intervenţia polimerazei δ şi îndepărtarea a  2 – 13 nucleotide (“long-patch BER”). În această cale alternativă, minoră la om, intervine şi PCNA (antigenul nuclear al celulelor proliferante) şi nucleaza FEN1 care împiedică formarea unor structuri secundare de către porţiunile ADN monocatenare apărute intermediar. Continuitatea catenei va fi restabilită de această dată de către ligaza 1.

(2). Repararea directă  monoenzimatică (MGMT). Prin intervenţia unor cataboliţi celulari reactivi se formează O6-metilguanina. În acest caz se produce o reparare directă, prin intervenţia enzimei metilguanin metil transferaza (MGMT); aceasta transferă gruparea metil de la nivelul O6-metilguaninei pe un reziduu propriu de cisteină (figura 6.21) formând 5-metilcisteina, o moleculă foarte stabilă, care inactivează enzima. Repararea sacrifică în întregime o moleculă proteică pentru fiecare leziune corectată. De aceea, acest mecanism de reparare este foarte rapid saturat atunci când organismul este supus unor agenţi alchilanţi exogeni.

(3). Repararea prin excizia nucleotidelor (nucleotid excision repair – NER). Calea de reparare NER este utilizată pentru corectarea a diferite tipuri de leziuni ADN asociate cu distorsiunea structurii dublu-helicoidale, precum dimerii de pirimidină produşi de radiaţiile UV sau modificările chimice determinate de benzpiren, aflatoxină şi cisplatin. Acest sistem de reparare este complex şi implică un număr mare de proteine şi gene.

Aceste gene au fost identificate la pacienţi cu diferite mutaţii ce produc trei afecţiuni rare: xeroderma pigmentosum (XP), sindromul Cockayne (CS) şi o formă cu fotosensibilitate a trichotiodistrofiei (TTD). Trăsătura comună este sensibilitatea foarte accentuată la expunerea solară ca urmare a reparării deficitare a leziunilor ADN induse de radiaţiile UV; în schimb, celelalte manifestări clinice sunt extrem de diferite. Pacienţii cu XP prezintă o creştere foarte accentuată, de peste 2000 de ori, a riscului pentru apariţia unui cancer cutanat şi, în multe cazuri, o neurodegenerare accelerată. Pacienţii cu CS prezintă anomalii neurologice degenerative progresive foarte severe şi manifestări de îmbătrânire precoce. TTD este caracterizată prin aspectul fragil al părului şi unghiilor, precum şi unele trăsături prezente şi în CS. Heterogenitatea clinică este consecinţă heterogenităţii genetice. Pentru XP sunt identificate 7 gene (XPA – XPG). În cazul CS sunt implicate 5 gene: CSA, CSB şi alele specifice ale XPB, XPD şi XPG. TTD varianta cu fotosensibilitate este determinată de mutaţia a 3 gene: din nou XPB şi XPD, precum şi TTDA.

Mecanismul prin care este recunoscută leziunea ADN este o problemă încă mult discutată. În prima etapă intervine un complex specific (XPC-hHR23B) care recunoaşte distorsiunea ADN produsă de agenţii mutageni şi localizează catena lezată. A doua etapă implică întreruperea activităţii helicazelor (XPB şi XPD din structura TFIIH) şi, în cazul particular al leziunilor induse de radiaţiile UV, fixarea la acest nivel a unui factor specific (UV-DDB, alcătuit din subunităţile p125 şi p48). Următoarea etapă în calea NER este formarea la nivelul leziunii a unui macroagregat proteic necesar pentru incizia duală a catenei care conţine leziunea. După îndepărtarea unui fragment de 24-32 de nucleotide care conţine leziunea, are loc resinteza ADN, prin intermediul ADN polimerazei δ sau ε, şi legarea capetelor, prin intermediul ligazei 1  (figura 6.22).

Modelul descris mai sus este utilizat pentru repararea ADN-ului netranscris, majoritar în genom. În cazul special al genelor transcrise, leziunile care impiedica activitatea de elongare realizată de ARN polimeraza II în cursul transcriptiei sunt reparate printr-un sistem cuplat cu transcriptia (transcription-coupled repair – TCR). Corectarea este realizată de 5-10 ori mai rapid, cu participarea aceloraşi factori utilizaţi pentru ADN-ul netranscris (cu excepţia XPC). Semnalul de recunoaştere a leziunii este blocarea progresiei ARN polimerazei II. În plus, intervin şi proteinele CSA şi CSB (implicate în sindromul Cockayne), care au rolul de a cupla activitatea ARN polimerazei II cu mecanismul de reparare.

c). Repararea   rupturilor  Adn  

                Rupturile monocatenare ale ADN sunt produse de speciile reactive de oxigen şi reparate prin intermediul enzimelor responsabile de ultimele etape ale mecanismului BER.

                Rupturile bicatenare ale ADN, mai rare decât cele monocatenare, pot apărea fie spontan (în cursul replicării, recombinării meiotice sau recombinării somatice VDJ, ce are loc în sinteza imunoglobulinelor), fie ca urmare a expunerii la radiaţiile ionizante. Repararea rupturilor bicatenare este un proces complex care se realizează în mai multe etape. Prima etapă constă în sesizarea prezenţei unei rupturi ADN bicatenare, prin intervenţia probabilă a unui complex multiproteic numit BASC (BRCA1-associated genome surveillance complex)[14]. Următoarea etapă este una de semnalizare, care implică activitatea a două kinaze înrudite: ATM şi ATR. Acestea produc activarea unor proteine importante pentru repararea propriu-zisă (NBS1 sau BRCA1) sau blocarea ciclului celular, la nivelul punctului de control G2/M (prin intermediul proteinelor MDM2 şi P53). După aceste etape comune, celula alege unul din mecanismele alternative de reparare: recombinare omologă sau unirea neomologă a capetelor.

§       Recombinarea omologă (homologous recombination – HR) este mecanismul cel mai frecvent utilizat la om şi este un mecanism de reparare precis, care utilizează pentru reparare o catenă de ADN intactă de pe cromatida soră sau de pe cromosomul omolog;

Recombinarea omologă debutează prin procesarea iniţială a capetelor rupte de către complexul NBS1-MRE11-RAD50 (activat de către proteina ATM) care va conduce la formarea unor capete 3’ monocatenare (figura 6.23). RAD52 se ataşează la capetele monocatenare astfel formate şi le protejează. Apoi, ADN-ul intact de la nivelul cromatidei soră sau a cromosomului omolog este utilizat ca matriţă pentru a înlocui informaţia genetică în cursul procesului nucleolitic. În final intervine o etapă de ligare care completează acest mecanism de reparare a ADN.

§       Unirea neomologă a capetelor (non-homologous end-joining – NHEJ) un mecanism predispus la erori (mici inserţii sau deleţii), în care capetele rupte ale ADN sunt unite fără nici o omologie, ori cu ajutorul unor secvenţe omologe scurte (< 10 pb).

Unirea neomologă a capetelor rupte debutează prin legarea heterodimerului KU70/KU80 la nivelul capetelor ADN care activează apoi o protein kinază ADN-dependentă. Intervine, de asemenea, complexul NBS1-MRE11-RAD50 care are atât activitate enzimatică cât şi structurală. Una dintre activităţile importante ale proteinei NBS pe această cale este activarea recombinazelor RAG1 şi RAG2 (care intervin în procesul de recombinare VDJ din cursul sintezei imunoglobulinelor). Complexul XRCC4/ligază 4 este necesar pentru unirea capetelor rupte. Repararea poate fi în acest caz fie precisă, fie cu pierderea sau adiţia unor nucleotide ceea ce  conduce la o mutaţie.

                Mutaţiile genelor care codifică proteine ce intervin în repararea rupturilor ADN pot determina numeroase boli: ataxia telangiectazia, sindromul Nijmegen, sindromul Bloom, anemia Fanconi, cancerul de sân ereditar. Majoritatea lor implică mutaţii ale proteinelor ce intervin în calea HR şi au transmitere recesivă, deşi există şi exemple de boli cu transmitere dominantă.

§       Ataxia telangiectazia (AT) este o afecţiune rară (circa 1 la 100.000 locuitori), care se manifestă clinic prin ataxie (datorită unei degenerări neuronale progresive), prezenţa telangiectaziilor vizibile în special la nivelul conjunctivei bulbare, radiosensibilitate, imunodeficienţă şi un risc crescut pentru apariţia cancerelor, mai ales a limfoamelor. Heterozigoţii (circa 1% din populaţie) au un risc crescut pentru cancerul de sân. Boala este determinată de mutaţia genei ATM (cromosomul 11q22) care codifică o protein kinază ce activează numeroase proteine implicate în căile de reparare ale rupturilor ADN sau în punctul de control G2/M a ciclului celular.

§       Cancerul de sân ereditar este una dintre cele mai frecvente boli genetice (circa 1 la 800 de indivizi) caracterizată printr-un risc crescut de apariţie a unui neoplasm mamar (36-85%), precum şi pentru cancerul de ovar (16-60%). Debutul bolii este adeseori precoce şi uneori bilateral. Au fost identificate două gene: BRCA1 (17q21) şi BRCA2 (13q12) ce codifică proteine care interacţionează cu RAD51 în calea de reparare HR a rupturilor ADN bicatenare (13).

 

                4.2. REPARAREA LEZIUNILOR LA NIVELUL ADN MITOCONDRIAL.

               

                Absenţa histonelor cu rol protector şi mediul foarte bogat în specii reactive de oxigen rezultate în cursul sintezei ATP fac ca ADN-ul mitocondrial să fie mult mai susceptibil la anumite tipuri de leziuni comparativ cu ADN-ul nuclear. În prezent se cunoaşte că la nivelul acestor organite funcţionează unele mecanisme de  reparare prezente şi la nivel nuclear, în timp ce altele sunt absente. Astfel, mitocondriile prezintă capacitatea de reparare a O6 metilguaninei prin intermediul enzimei MGMT. De asemenea, au fost identificate numeroase componente care intervin în mecanismul BER, precum unele ADN glicozilaze, endonucleaza APE1 etc. În schimb, mecanismul NER este absent. Rata mutaţiilor care persistă în urma intervenţiei acestor mecanisme de reparare este considerată a fi de 10 ori mai mare decât în cazul genomului nuclear şi aceasta contribuie la procesul de îmbătrânire şi la apariţia unor boli degenerative.

                4.3. TOLERAREA LEZIUNILOR ADN

                În punctele de control ale ciclului celular sunt declanşate mecanismele care blochează progresia celulelor cu leziuni ale ADN pentru a permite repararea lor înaintea replicării. Dar aceasta viziune este o suprasimplificare deoarece în prezent devine tot mai clar faptul că, în anumite condiţii   (de exemplu, „saturarea” mecanismelor de replicare datorită leziunilor prea numeroase) celulele pot tolera unele dintre leziunile ADN, fără a le corecta. Când ajung în dreptul leziunii catenei matriţă, ADN polimerazele  sunt confruntate cu următoarea alternativă:

§       inseră la întâmplare un nucleotid şi depăşesc astfel „punctul critic”, replicând restul ADN din replicon; celula supravieţuieşte dar leziunea ADN persistă; efectul va depinde de localizarea leziunii în genom;

§       lasă o breşă în catena nou sintetizată şi reiau replicarea în aval de locul leziunii; lacuna produsă poate fi uneori rezolvată ulterior (prin intervenţia unui sistem enzimatic de recombinare postreplicativă).

Prin ambele alternative se poate corecta leziunea sau se produce o reparare infidelă, cu defect.

 

C. ANOMALIILE  CROMOSOMICE

 

Anomaiile cromosomice pot fi definite ca fiind modificări produse de o alterare vizibilă a cromosomilor. Evidenţierea acestor modificări depinde de tehnica de studiu folosită. Dacă rezoluţia maximă a metodelor tradiţionale este de circa 4 megabaze, tehnicile de citogenetică moleculară permit observarea unor leziuni cu mult mai mici, ceea ce  face dificilă delimitarea clară între anomalii cromosomice şi mutaţiile genice masive (macroleziuni). În aceste condiţii, anomaliile cromosomice se definesc ca modificări genetice produse prin mecanisme cromosomice specifice: segregarea anormală a cromosomilor în meioză sau mitoză, recombinare intercromosomică aberantă sau reparare greşită a rupturilor cromosomice.

 Cele mai multe dintre anomaliile cromosomice produc un dezechilibru genetic care determină anomalii fenotipice diverse (întârziere de creştere şi dezvoltare, anomalii congenitale multiple, retard mintal, tulburări de sexualizare şi reproducere, unele forme de cancere, ş.a) şi cu gravitate diferită. Dacă la aceste consecinţe clinice variate şi semnificative, prezente în numeroase specialităţi medicale, adăugăm şi frecvenţa mare a anomaliilor cromosomice (≥ 8% din sarcinile recunoscute clinic, 0,7-1% nou născuţii vii) atunci obţinem argumente solide pentru a aprecia ca patologia cromosomică este o problemă majoră de sănătate publică.

 

1.       TIPURILE ŞI MECANISMELE DE PRODUCERE

ALE ANOMALIILOR CROMOSOMICE.

 

                1.1 CLASIFICAREA ANOMALIILOR CROMOSOMICE

 

             Anomaliile cromosomice pot fi clasificate în raport cu mai multe criterii (tabelul 6.4).

             După momentul producerii lor, anomaliile cromosomice se împart în: anomalii constituţionale şi anomalii dobândite. Anomaliile constituţionale sunt prezente la naştere şi au originea în cursul gametogenezei unuia dintre părinţi sau în primele etape ale embriogenezei. Anomaliile dobândite apar ulterior în cursul vieţii, sub forma unor clone celulare anormale.

 

Tabelul 6.4 Clasificarea anomaliilor cromosomice

 

Criteriu

Tip de anomalie

momentul apariţiei

constituţionale

dobândite

modul de afectare al materialului genetic

numerice

    - poliploidii

    - aneuploidii

structurale

    - echilibrate

    - neechilibrate

disomii   

     uniparentale

numărul de celule afectate

omogene

în mozaic

tipul de cromosom afectat

autosomale

gonosomale

tipul de celule afectate

somatice

germinale

             În raport cu modul de afectare al materialului cromosomic anomaliile pot fi împărţite în: numerice, structurale şi funcţionale.

§       Anomaliile cromosomice numerice sunt modificări ale numărului de cromosomi în raport cu numărul normal diploid de 2n = 46 de cromosomi. Anomaliile numerice se clasifică în: poliploidii şi aneuploidii. Poliploidiile reprezintă prezenţa în plus a unuia sau mai multor seturi haploide complete de cromosomi. Aneuploidiile se caracterizează prin prezenţa în plus sau absenţa unuia sau mai multor cromosomi.

§       Anomaliile cromosomice structurale se caracterizează prin modificarea structurii normale a cromosomilor. Ele se împart, în raport cu efectul fenotipic, în: anomalii echilibrate şi anomalii neechilibrate. Anomaliile cromosomice structurale echilibrate (translocaţii şi inversii) sunt caracterizate printr-o modificare a poziţiei unuia sau mai multor segmente cromosomice, fără afectarea cantităţii totale de material genetic şi, implicit, fără afectarea fenotipului (în marea majoritate a cazurilor). Anomaliile cromosomice structurale neechilibrate (deleţii, duplicaţii, cromosomi inelari, cromosomi dicentrici şi isocromosomi) sunt caracterizate prin prezenţa suplimentară (trisomie parţială) sau absenţa (monosomie parţială) unor părţi din cromosom sau asocierea dintre surplusul şi lipsa unuia sau mai multor segmente cromosomice.

§       Anomaliile cromosomice funcţionale sunt reprezentate de disomia uniparentală, caracterizată prin prezenţa la acelaşi individ a unei perechi de cromosomi ce provine de la acelaşi genitor.

             În raport cu numărul de celule afectate, anomaliile cromosomice pot fi împărţite în: omogene şi în mozaic. Anomaliile omogene se caracterizează prin prezenţa anomaliei în toate celulele individului afectat. Anomaliile în mozaic sunt caracterizate de prezenţa a două sau mai multe linii celulare care diferă prin numărul de cromosomi, dar derivă din acelaşi zigot.

                În funcţie de tipul de cromosom afectat, anomaliile cromosomice se clasifică în: anomalii autosomale (sunt interesaţi unul sau mai mulţi autosomi) anomalii gonosomale (anomalia implică cromosomii X sau Y) şi anomalii mixte (când sunt implicaţi cel puţin un autosom şi un gonosom).

În raport cu tipul celulei afectate, anomaliile cromosomice se clasifică în: anomalii somatice (modifică fenotipul individului afectat) şi anomalii germinale (anomalia nu modifică fenotipul pacientului, dar se poate transmite prin gameţi la descendenţi).

                Pentru nomenclatura tuturor acestor tipuri de anomalii cromosomice se foloseşte un sistem standardizat, elaborat de participanţii la diferite conferinţe internaţionale (ISCN[15], Paris, 1995; vezi tabelul 2.6 şi capitolul 2.D.3.3).

 

1.2. ANOMALIILE CROMOSOMICE NUMERICE

 

Numărul de cromosomi al speciei umane este de 46. Celulele somatice normale sunt diploide (2n=46 cromosomi) în timp ce celulele sexuale mature normale – ovulul şi spermatozoidul – sunt haploide (n=23 cromosomi). Anomaliile numărului de cromosomi se împart în două categorii: poliploidii şi aneuploidii; acestea pot fi omogene sau în mozaic[16].

Este util de precizat că orice multiplu exact  a lui n este numit  euploidie; constituţia cromosomică euploidă (n, 2n, 3n, 4n) nu este obligatoriu normală. Termenul de aneuploidie se referă la orice situaţie în care numărul de cromosomi nu este euploid, fie că un cromosom este în plus sau lipseşte

a). Poliploidiile

                Poliploidiile se caracterizează prin prezenţa în plus a unuia sau mai multor seturi haploide (n=23) de cromosomi. Singurele poliploidii identificate la om sunt: triploidia (3n=69 cromosomi) şi tetraploidia (4n=92 cromosomi). Cauza cea mai frecventă a triploidiei este dispermia (fecundarea unui ovul de către doi spermatozoizi; mai rar, triploidia poate rezulta prin fertilizarea unui gamet normal (n) de către un gamet diploid (2n): spermatozoid  (diandrie) sau ovul (diginie). Tetraploidia se produce de obicei printr-o eroare în prima diviziune a zigotului: ADN a fost replicat şi cantitatea totală devine 4C, dar nu are loc diviziunea.

                Poliploidiile se caracterizează prin modificări importante ale cantităţii de material genetic, care produc modificări majore ale fenotipului, de obicei cu efect letal; acest fapt determină pierderea foarte precoce, în primele săptămâni de sarcină, a produsului de concepţie poliploid. Astfel, triploidiile se întâlnesc la 1-3% din sarcinile recunoscute clinic dar marea majoritate a embrionilor sunt eliminaţi (15-20% din avorturile spontane cu anomalii cromosomice); triploidia (deobicei sub formă de mozaic 3n/2n) se găseşte numai la 1 din 10.000 de nou-născuţii vii, care, evident, nu supravieţuiesc.

Deşi poliploidiile omogene au efecte foarte grave, în unele ţesuturi umane pot fi întâlnite în mod normal celule poliploide. Astfel, în ficat celulele implicate în regenerarea hepatică sunt tetraploide, în timp ce în măduva osoasă hematogenă există megacariociote octaploide sau chiar cu 16 seturi haploide de cromosomi.

                b). Aneuploidiile

                Aneuploidia reprezintă o anomalie cromosomică[17] produsă fie prin pierderea unui cromosom (monosomie), fie prin prezenţa în exces a unui cromosom (trisomie), mai rar a doi cromosomi (tetrasomie); ele pot interesa autosomii sau cromosomii sexuali.

§       Monosomiile sunt anomalii caracterizate prin prezenţa într-o celulă somatică a unui singur cromosom, în locul unei perechi de cromosomi (2n-1). Monosomiile autosomale au fost descrise numai la embrioni şi, fără excepţie, monosomiile autosomale complete sunt letale. Singura monosomie compatibilă cu viaţa la om este monosomia X.

§       Trisomiile se caracterizează prin prezenţa într-o celulă somatică  a trei exemplare ale aceluiaşi cromosom, în locul perechii normale de cromosomi omologi (2n+1). La specia umană majoritatea trisomiilor complete sunt letale, ducând la avorturi spontane precoce. Singurele excepţii sunt trisomiile autosomale: 21, 18, 13, 8 (dar numai în mozaic), şi cele gonosomale (XXX, XXY şi XYY).

§       În cazul anomaliilor gonosomilor sunt posibile şi tetrasomii (48,XXXX, 48,XXYY, 48,XXXY) sau chiar pentasomii (49,XXXXX, 49,XXXXY). Au fost descrise însă tetrasomii parţiale: 9p, 12p, 18p, 21q

                Aneuploidiile omogene sunt consecinţa unor erori produse în cursul meiozei: nedisjuncţia cromosomică în meioza I, nedisjuncţia cromatidiană în meioza II şi întârzierea (pierdere) anafazică (vezi capitolul 5.C.3.1.b). Nedisjuncţia în meioză produce gameţi anormali – cu 24 de cromosomi (disomici) sau cu 22 de cromosomi (nulisomici) – care după unirea cu un gamet normal formează zigoţi trisomici sau nulisomici (vezi figura 5.20). Despre nedisjuncţie am discutat pe larg în capitolul 5.C.1.3 (vezi şi caseta 5.3); vom reaminti numai că nedisjuncţia meiotică este frecventă (circa 8% din toate sarcinile recunoscute clinic) şi se produce mai ales în ovogeneză, în special în meioza I. Totuşi, nedisjuncţia meiotică paternă este frecventă (70%) în monosomia X şi 100% în trisomia XYY. Întârzierea anafazică este un accident care se poate produce în anafazele ambelor meioze (mai frecvent în anafaza II) şi constă în blocarea migrării sau reducerea vitezei de migrare a unui cromosom (cromatidă) urmată de pierderea sa din nucleu. Rezultă gameţi nulisomici, care prin fertilizare cu gameţi normali vor produce zigoţi cu monosomie.

                Aneuploidiile în mozaic sunt de obicei consecinţa unor erori ale mitozei: nedisjuncţia cromatidiană (care va determina mozaicuri cromosomice de tipul 47/45 sau 47/46/45) şi întârzierea anafazică (produce mozaicuri 46/45 dar numai la cromosomii sexuali -  46,XX/45,X sau 46,XY/45,X – deoarece implicarea unui alt cromosom duce la apariţia de celule monosomice neviabile. Un alt posibil mecanism pentru formarea mozaicurilor cromosomice numerice îl reprezintă “corecţia sau salvarea” unei trisomii omogene la zigot. Deoarece, trisomiile sunt anomalii grave, organismul încearcă corectarea acestora prin pierderea cromosomului suplimentar. În condiţiile în care acest mecanism acţionează doar în unele celule, va rezulta un mozaic de tipul 2n+1/2n (47/46)[18].

De multe ori, în aceste cazuri, mozaicul este limitat la nivelul placentei (confined placental mosaicism) embrionul fiind normal. De regulă un astfel de mozaic este consecinţa unui mecanism de salvare al unei trisomii iniţiale şi poate conduce la apariţia unei disomii uniparentale (vezi secţiunea 1.4). Într-o astfel de situaţie, este foarte dificilă alegerea unei opţiuni referitoare la finalizarea sarcinii, deoarece pe de o parte prezenţa unei placente anormale determină tulburări ale creşterii embrionare şi fetale, iar pe de altă parte există riscul ca viitorul copil să prezinte o formă de disomie uniparentală.

 

1.3. Anomaliile cromosomice structurale

 

Anomaliile cromosomice de structură (numite şi „mutaţii cromosomice”) se produc, în mod clasic,  prin ruperea cromosomilor şi reunirea anormală a capetelor cromosomilor rupţi.

În condiţii experimentale – prin tratarea celulelor umane în cultură cu agenţi „clastogeni” (radiaţii ionizante sau unele substanţe chimice) – s-a stabilit că ruperea unui cromosom produce două capete instabile, deoarece nu au telomere. Mecanismele de reparare asigură de obicei reunirea corectă a capetelor rupte şi refacerea integrităţii cromosomice („restituţio ad integrum”). Totuşi, când se produc mai multe rupturi – în unul, doi sau mai mulţi cromosomi – se poate produce o reunire incorectă a capetelor rupte şi rezultă cromosomi „derivativi”, cu o structură anormală. Ei pot fi stabili în condiţiile în care au un centromer şi telomere, structuri ce le asigură segregarea/ transmiterea lor în cursul diviziunii celulare. În schimb, cromosomii derivativi acentrici, dicentrici sau fără telomere se caracterizează printr-o instabilitate crescută şi se vor pierde în timpul diviziunii.

Cele mai multe anomalii structurale spontane, din celulele germinale sau somatice, se produc însă foarte probabil prin erori de recombinare.

Recombinarea meiotică este precedată de sinapsa cromosomilor omologi, ce implică împerecherea unor secvenţe identice sau foarte asemănătoare de ADN repetitiv din structura lor; împerecherea incorectă generează, prin crossing over inegal, deleţia sau duplicaţia unor segmente cromosomice. De asemenea, se poate produce o sinapsă între regiuni identice din cromosomi  neomologi, care poate să determine o recombinare accidentală şi producerea unui transfer de segmente între aceşti cromosomi (o translocaţie). Recombinarea omologă nealelică sau ectopică se poate produce şi în celulele somatice, între cromatidele unui cromosom sau între cromosomi omologi (vezi sectiunea 6.B.1.3)

În funcţie de numărul de cromosomi implicaţi şi de numărul de rupturi se produc (prin reparare greşită sau recombinare între cromosomi neomologi) mai multe tipuri de anomalii structurale stabile, sistematizate în tabelul 6.5; la acestea se adaugă un tip special reprezentat de isocromosomi.

 

Tabelul 6.5 Anomalii structurale stabile produse prin repararea greşită

a rupturilor cromosomice sau erori de recombinare.

(după Strachan şi Read, 1999)

 

Un cromosom implicat

Doi cromosomi implicaţi

O ruptură

Deleţie terminală

Două rupturi

Deleţie interstiţială

Cromosom inelar

Duplicaţie sau deleţie prin schimb inegal

         între cromatidele surori

Inversie

Translocaţie reciprocă

Translocaţie Robertsoniană

Duplicaţie sau deleţie

        prin recombinare inegală

Trei rupturi

Rearanjări cromosomice variate

         (de ex., inversie cu deleţie; inserţie

          intracromosomică)

Inserţie intracromosomică

        (directă sau inversată)

                În funcţie de consecinţele fenotipice pe care le produc, anomaliile de structură ale cromosomilor se împart în:

§       anomalii echilibrate când nu se produce pierdere sau câştig de material cromosomic (translocaţii reciproce echilibrate, inversii) iar fenotipul este, de regulă, normal;

§       anomalii neechilibrate atunci când există plus sau minus de material cromosomic (deleţii, cromosomi inelari, duplicaţii) care produce un fenotip anormal.

a). Anomaliile structurale ce implică un singur cromosom.

(1). Deleţiile

                Deleţiile (del) sunt anomalii cromosomice structurale neechilibrate, caracterizate prin pierderea unui fragment cromosomic.

§       În funcţie de localizarea segmentului pierdut, deleţiile pot fi terminale şi interstiţiale.

         Clasic, deleţiile terminale rezultă prin ruperea unui cromosom într-un punct, urmată de pierderea fragmentului terminal acentric şi formarea unui nou telomer la capătul rupt. Deleţiile interstiţiale sunt produse prin ruperea unui cromosom în două puncte, situate pe acelaşi braţ, urmată de pierderea fragmentului interstiţial şi reunirea fragmentelor restante (figura 6.24).

         În prezent, se consideră că marea majoritate a deleţiilor sunt interstiţiale iar mecanismul cel mai frecvent de producere îl reprezintă recombinarea omologă nealelică intracromosomică sau intercromosomică, mediată de o împerechere greşită a cromosomilor, datorită unor secvenţe repetitive identice sau foarte asemănătoare dar nealele (figura 6.24). Deleţiile se mai pot produce prin segregarea meiotică a cromosomilor cu translocaţii echilibrate, inserţii sau inversii (vezi secţiunile următoare).

§       Din punct de vedere al dimensiunilor, deleţiile se împart în deleţii microscopice (≥ 5Mb) –  vizibile prin marcaj cromosomic, de preferinţă a celui de înaltă rezoluţie – şi deleţii submicroscopic,e evidenţiate prin folosirea tehnicilor de citogenetică moleculară (FISH), cu sonde pentru regiunea presupusă a fi absentă din cariotipul individului.

                 În practică, cele mai frecvente deleţii sunt descrise în braţele scurte ale cromosomilor 4 (sindromul Wolf Hirschhorn), 5(sindromul cri du chat), 11, şi 18, precum şi în braţele lungi ale cromosomilor 7, 11, 13, 15, 18, 21 şi 22;  de asemenea pot fi implicaţi în deleţii şi cromosomii X şi Y. Deleţiile autosomale microscopice au o incidenţă de 1 la 7000 nou născuţi vii. Cea mai frecventă deleţie, de obicei submicroscopică, este del 22q11 (sindromul DiGeorge-Velocardiofacial) cu o incidenţă de 1 : 2000.

Toate deleţiile produc o monosomie parţială (haploinsuficienţă) pentru genele localizate în regiunea cromosomică absentă. Viabilitatea produsului de concepţie cu deleţie depinde de dimensiunea fragmentului absent. În general, se consideră că o monosomie parţială ce depăşeşte 2% din lungimea unui set haploid de cromosomi este incompatibilă cu supravieţuirea. Deleţiile submicroscopice sau microdeleţiile produc sindroame ale genelor contigue, în care manifestările fenotipice sunt determinate de pierderea mai multor gene învecinate. Principalele sindroame cromosomice cu deleţii sau microdeleţii sunt prezentate în capitolul 10.

(2). Cromosomii inelari

Cromosomii inelari (r), sunt cromosomi anormali, caracterizaţi printr-o conformaţie circulară. Mecanismul de producere al acestei anomalii constă în ruperea unui cromosom în două puncte localizate pe braţe diferite, urmată de pierderea fragmentelor acentrice (terminale) şi unirea capetelor fragmentului centric (figura 6.25). Practic se realizează o deleţie / o monosomie parţială a unor segmente terminale din braţele cromosomului.

Cromosomii inelari întâmpină dificultăţi de segregare în cursul mitozei, fiind caracterizaţi printr-o mare instabilitate. Datorită acestei particularităţi frecvenţa cromosomilor inelari este redusă. În practica medicală au fost descrise cazuri cu: r(X), r(21), r(18), r(22) şi r(15).

(3). Duplicaţiile

                Duplicaţiile (dup) sunt anomalii cromosomice structurale neechilibrate, caracterizate prin prezenţa pe unul dintre cromosomi a unui segment în dublu exemplar. Consecinţa genotipică o reprezintă apariţia unei trisomii parţiale pentru segmentul cromosomic duplicat.

                Majoritatea duplicaţiilor sunt rezultatul unui crossing-over inegal între cromosomii omologi în cursul pahitenului, favorizat de prezenţa unor secvenţe de ADN repetitiv sau de similitudinea între secvenţele unor gene (figura 6.26). Alte surse de trisomii parţiale sunt recombinarea intracromosomică la nivelul unei inversii şi segregarea cromosomilor în meioza I în cazul unor translocaţii echilibrate.

                Cele mai frecvente duplicaţii sunt: dup12q, care produce sindromul Pallister şi dup17q care determină boala Charcot – Marie – Tooth (vezi 6.B.1.3).

(4). Inversiile

                Inversiile (inv) rezultă prin ruperea cromosomului în două puncte, urmată de rotirea fragmentului intermediar cu 1800 şi reunirea fragmentelor. În funcţie de localizarea punctelor de ruptură, inversiile se clasifică în:

§       paracentrice – dacă cele două puncte de ruptură sunt situate pe acelaşi braţ, iar fragmentul rotit nu conţine centromerul (figura 6.27.a);

§       pericentrice – dacă cele două puncte de ruptură sunt situate pe braţe diferite, iar fragmentul rotit conţine centromerul (figura 6.27.b); pot produce modificarea morfologiei cromosomului.

Inversiile sunt anomalii cromosomice echilibrate, care nu produc, de regulă, modificări fenotipice[19], deoarece nu determină modificări ale cantităţii de material genetic, ci doar repoziţionarea unor gene în cromosom. Excepţiile apar când unul din punctele de ruptură este localizat în interiorul unei gene, ducând la modificarea distanţei dintre porţiunea centrală şi cea reglatoare a unei gene sau la disrupţia secvenţei codante.

                În schimb, inversiile pot produce tulburări reproductive (sterilitate, avorturi spontane, naşterea unor copii plurimalformaţi) determinate de recombinarea intracromosomică în regiunea cu inversie. Datorită faptului că genele nu mai sunt poziţionate normal, sinapsa între cromosomii omologi nu se poate face corect (“genă la genă”) decât dacă cromatida cu inversie formează o buclă la nivelul inversiei (figura 6.28). Producerea unui crossing-over la acest nivel poate produce gameţi neechilibraţi; tipul de anomalie cromosomică depinde de tipul de inversie.

§       În cazul inversiilor paracentrice, gameţii anormali pot avea un cromosom dicentric sau un cromosom acentric (figura 6.28.a); ambii sunt instabili, iar supravieţuirea unui embrion cu astfel de anomalii este improbabilă. De aceea un cuplu în care unul dintre membri este purtător al unei inversii paracentrice va avea doar copii sănătoşi (normali sau purtători de inversie) şi un număr mare de avorturi spontane repetate.

§       În cazul inversiilor pericentrice, gameţii anormali pot avea cromosomi cu duplicaţia (trisomie parţială) şi deleţia (monosomie parţială) segmentelor cromosomice distale de inversie  (figura 6.28.b);

Circa una la 1000 de persoane din populaţia generală  poartă o inversie şi are un risc de 5-10%  – în funcţie de mărimea şi poziţia inversiei, precum şi de crosomomul implicat – de a avea un descendent cu cariotip anormal.

(5). Isocromosomii

Isocromosomii (i) sunt cromosomi anormali, simetrici, caracterizaţi prin prezenţa în dublu exemplar a unuia dintre braţe (trisomie parţială) şi absenţa (monosomie parţială) celuilalt braţ. (figura 6.29); pot fi deci isocromosomi de braţ scurt sau de braţ lung.

                Mecanismul clasic de formare a isocromosomilor implică o eroare mitotică – clivarea transversală a centromerului – care determină formarea unui cromosom alcătuit numai din braţe scurte şi a unuia constituit numai din braţe lungi. Totuşi, acest mecanism a fost rareori dovedit. Un mecanism mult mai probabil este reprezentat de apariţia unui schimb inegal de material cromosomic între cromosomii omologi (cromatidele surori) la extremitatea proximală a braţelor, adiacent centromerului. În acest mod rezultă de fapt un cromosom dicentric, dar prin metodele citogenetice clasice este imposibilă vizualizarea ambelor centromere, localizate foarte apropiat unul de celălalt.

                Cel mai frecvent isocromosom este i(Xq) identificat la unele paciente cu sindrom Turner. Mai rar au fost depistaţi isocromosomi ai unor autosomi – i(18p), i(12p), i(21q).

(6). Cromosomii marker

                Pe preparatele cromosomice se observă ocazional cromosomi foarte mici, a căror origine este dificil de stabilit, numiţi cromosomi „marker”. Frecvent ei sunt prezenţi sub formă de mozaic cromosomic, reprezentând un extra-cromosom sau cromosom supranumerar faţă de cariotipul normal sau anormal de bază. Cromosomii marker pot conţine secvenţele pericentromerice ale unui cromosom (mai frecvent 15 sau X) sau pot fi mici cromosomi inelari. Cea mai dificilă problemă este identificarea unui cromosom marker supranumerar în anlizele prenatale (1:2500); din cauza originii diferite – dificil de stabilit prin tehnicile uzuale – riscul unor anomalii fetale asociate poate varia de la foarte mic, la foarte mare.

 

b). Anomaliile structurale ce implică doi cromosomi.

                (1). Translocaţiile

Translocaţiile se caracterizează prin transferul de segmente cromosomice între doi cromosomi, de obicei neomologi. Pot fi trei tipuri majore: translocaţii reciproce, translocaţii prin fuziune centrică (Robertsoniene) şi inserţii

 

Translocaţiile reciproce

 

Translocaţiile reciproce (t) se produc prin ruperea (în cursul interfazei) a doi cromosomi neomologi, fiecare în câte un punct, urmată de schimbul reciproc al fragmentelor acentrice şi realipirea fragmentelor rupte, cu formarea a doi cromosomi derivativi (figura 6.30.a).

Incidenţa translocaţiilor reciproce în populaţia generală este de aproximativ 1:400 de indivizi. Frecvenţa acestor anomalii este mai mare la bărbaţii cu sterilitate primară şi la cuplurile cu avorturi spontane recurente. De regulă, translocaţiile reciproce sunt specifice unei anumite familii. O translocaţie relativ frecventă este însă aceea dintre braţele lungi ale cromosomilor 11 şi 22.

                Purtătorii de translocaţii reciproce echilibrate au de obicei un fenotip normal, deoarece anomalia nu modifică cantitatea totală de material genetic. În schimb, pot apărea tulburări de reproducere, determinate de modul particular de sinapsă şi de segregare a cromosomilor derivativi, cu translocaţia de segmente, în cursul meiozei I. Translocaţiile reciproce pot determina blocarea spermatogenezei şi sterilitate; femeile purtătoare pot avea o fertilitate redusă. Atunci când gametogeneza este posibilă se pot forma gameţi normali şi anormali, funcţie de modul de segregare (figura 6.30.b şi c).

În cursul meiozei I, datorită translocaţiei reciproce, cromosomii omologi formează o sinapsă specială, numită cvadrivalent, cu aspect de cruce (figura 6.30.b). La nivelul acestei structuri se produce alinierea regiunilor omologe ale cromosomilor implicaţi în translocaţie. În cursul anafazei I, când se produce segregarea cromosomilor omologi, cromosomii cvadrivalentului pot urma trei căi de segregare: 2:2; 3:1; 4:0 – diferite prin numărul cromosomilor ce se distribuie celulelor fiice. Ultimele două căi, complet dezechilibrate, sunt foarte rare şi conduc la gameţi cu anomalii genetice majore, incompatibili pentru reproducere. Segregarea 2:2 se poate face în trei moduri (figura 6.30.c): altern, adiacent-1  şi adiacent-2.

§       În cazul segregării alterne, cromosomii normali migrează la un pol al fusului de diviziune, la celălalt pol deplasându-se cromosomii cu translocaţie. Astfel, rezultă gameţi echilibraţi genetic, prin a căror fecundare se formează, fie zigoţi normali, fie zigoţi purtători ai translocaţiei echilibrate.

§       În segregarea adiacentă-1 centromerii neomologi segregă împreună, în timp ce în segregarea adiacentă-2 se produce o segregare asociată a centromerilor omologi. În ambele tipuri de segregare rezultă gameţi anormali (cu disomie şi nulisomie parţială), care prin fecundare vor conduce la zigoţi ce asociază trisomia parţială a unuia dintre cromosomi cu monosomia parţială a celuilalt cromosom.

În translocaţiile reciproce echilibrate  riscul teoretic de apariţie a unor descendenţi anormali (cu trisomie sau monosomie parţială) este ridicat – 50% – dar riscul practic de apariţie a unor copii cu anomalii cromosomice neechilibrate este de 1-10%, dependent de tipul translocaţiei, deoarece majoritatea embrionilor neechilibraţi sunt neviabili.

Translocaţiile robertsoniene

 

                Translocaţiile Robertsoniene (rob) implică doi cromosomii acrocentrici (exceptând cromosomul Y), omologi sau neomologi. Aceştia se rup la nivelul centromerelor sau pe braţele scurte, foarte aproape de centromer, braţele lungi fuzionează şi formează un cromosom derivativ, monocentric sau pseudodicentric, iar braţele scurte se pierd (figura 6.31). Ca urmare, numărul de cromosomi se reduce la 45; deoarece braţele scurte ale celor cinci perechi de acrocentrici au copii multiple ale genelor pentru ARN ribosomal, pierderea braţelor scurte a doi acrocentrici nu va fi nocivă (rămân un număr suficient de copii pe cromosomii acrocentrici normali) iar fenotipul va fi normal,

                Incidenţa globală a translocaţiilor Robertsoniene în populaţie este de aproximativ 1/1000 de indivizi, cele mai frecvente fiind translocaţiile dintre cromosomii 13 şi 14 –  rob(13q14q) –  şi între cromosomii 21 şi 14 – rob(21q14q); afectând aproximativ 1/1300 de persoane, rob(13q14q) este cea mai frecventă anomalie structurală la om.

                Translocaţiile Robertsoniene, deşi nu afectează fenotipul, pot produce gameţi şi descendenţi anormali. Riscul de apariţie a unor descendenţi anormali este diferit în funcţie de tipul cromosomilor implicaţi în translocaţie (omologi sau neomologi) şi de sexul părintelui purtător.

§       În cazul unei translocaţii între cromosomi neomologi, de exemplu între cromosomii 14 şi 21, se pot forma 6 tipuri de gameţi (figura 6.31.c.); prin fecundarea lor cu gameţi normali rezultă şase tipuri de zigoţi: normal, echilibrat cu translocaţie Robertsoniană, cu trisomie 14, cu monosomie 14, cu trisomie 21, cu monosomie 21. Zigoţii monosomici şi cu trisomie 14 dau embrioni neviabili, eliminaţi prin avorturi spontane. În această situaţie, riscul teoretic de apariţie al unui copil cu trisomia 21 (sindrom Down) este de 33%; riscul real este mai mic (deoarece o parte din embrionii cu trisomie 21 sunt eliminaţi prin avort spontan) şi depinde de sexul purtătorului: în cazul femeilor riscul este de 10%, în timp ce la bărbaţi riscul este de 1-3%, deoarece anomalia blochează de obicei spermatogeneza.

§       O situaţie specială se întâlneşte în cazul purtătorilor unei translocaţii Robertsoniene între cromosomi omologi, de exemplu, între doi cromosomi 21; ei formează gameţi cu disomie 21 şi cu nulisomie 21 care, după fecundare cu un gamet normal, vor forma zigoţi cu trisomie 21 sau cu monosomie 21 (neviabili). Acest caz constituie una din puţinele situaţii în care riscul de recurenţă al unei afecţiuni genetice este de 100%.

Inserţiile

               

Inserţiile (ins) sunt translocaţii nereciproce, care implică transferul unui fragment cromosomic de pe un cromosom pe un cromosom neomolog. Mecanismul de apariţie al anomaliei constă în ruperea a doi cromosomi neomologi, dar necesită trei puncte de ruptură, două pe un cromosom şi unul pe celălalt cromosom; fragmentul liber al cromosomului cu două rupturi este transferat şi inserat (în poziţie normală sau inversat) la nivelul punctului de ruptură al celui de-al doilea cromosom (figura 6.32). Datorită acestei particularităţi, inserţiile sunt anomalii cromosomice relativ rare.

                În cazul inserţiilor, anomalia nu modifică fenotipul purtătorului, dar poate conduce la tulburări de reproducere, datorite malsegregării cromosomilor derivativi în cursul meiozei I. Un individ purtător al unei translocaţii cu inserţie poate avea copii normali, copii purtători ai anomaliei echilibrate, copii cu monosomie parţială şi copii cu trisomie parţială.

 

(2). Cromosomii dicentrici

 

                Cromosomii dicentrici (dic) se formează printr-o translocaţie neechilibrată, cu ruperea în câte un punct a doi cromosomi, urmată de unirea fragmentelor centrice într-un cromosom derivativ şi pierderea fragmentelor acentrice. Numărul de cromosomi din celulă se reduce de la 46 la 45 (figura 6.33). De obicei, cromosomii dicentrici sunt instabili în cursul mitozei[20]; menţinerea lor pe parcursul a mai multor generaţii celulare se face  prin inactivarea unuia dintre centromere (pseudodicentrici).

 

1.4. DISOMIILE UNIPARENTALE

               

Disomiile uniparentale sunt anomalii cromosomice funcţionale, caracterizate prin prezenţa unei perechi de cromosomi moştenite de la acelaşi genitor (vezi şi capitolul 5.C.3.2).

Mecanismul de producere a disomiilor uniparentale implică procese de corectare (“salvare”) a unor aneuploidii omogene, existente în primele etape ale embriogenezei. În cazul corectării unei monosomii, aceasta poate fi “salvată” prin duplicarea cromosomului implicat, rezultând obligatoriu o disomie uniparentală. În cazul prezenţei unei trisomii, corecţia constă în eliminarea unuia dintre cei trei cromosomi omologi; în funcţie de originea trisomiei (nedisjuncţie în mieoza I sau în meioza II) (vezi figura 5.20) şi de cromosomul pierdut există trei posibilităţi:

§       zigot disomic normal, cu câte un cromosom de la fiecare din părinţi;

§       zigot cu doi cromosomi identici de la un părinte (isodisomie);

§       zigot cu doi cromosomi diferiţi de la un părinte (heterodisomie).

Disomia uniparentală poate avea efecte patologice atunci când realizezază o stare de homozigoţie a unei gene recesive sau cînd cromosomul implicat conţine gene amprentate (vezi capitolul 4.D.1.2.b)

Genomurile parentale nu sunt echivalente funcţional. La nivelul anumitor loci se exprimă fenotipic, fie alela de origine maternă, fie cea de origine paternă (cea de a doua alelă fiind inactivă). Amprentarea genomică (parentală) este stabilită în cursul spermatogenezei sau ovogenezei şi constă în marcarea specifică a anumitor gene localizate pe unii cromosomi. Procesul are două etape: ştergerea amprentării moştenită de la părinţi şi introducerea noii amprentări caracteristice sexului individului respectiv (vezi figura 4.22). Zigotul rezultat în urma fertilizării gameţilor va moşteni astfel două genomuri parentale marcate specific şi diferite funcţional. Marcarea acestor gene, de regulă implicate în embriogeneză, constă fie în inactivarea prin metilare a uneia dintre alele (maternă sau paternă) fie în modificarea regiunii reglatoare a uneia dintre alele.

Un exemplu de corectare a unei trisomii 15 este prezentat în figura 6.34. În cazul trisomiei 15 de origine paternă, prin pierderea cromosomului 15 de origine maternă se va naşte un copil cu sindrom Angelman. În cazul trisomiei 15 de origine maternă, prin pierderea cromosomului 15 de origine paternă se va naşte un copil cu sindrom Prader-Willi.

                Teoretic, pot exista disomii uniparentale pentru toţi cromosomii umani. Până la ora actuală au fost identificate 23 de disomii uniparentale, dintre care următoarele au implicaţii patologice: 15q paternă (sindrom Angelman), 15q maternă (sindrom Prader-Willi), 11p paternă (sindrom Beckwith-Wiedemann), 6 paternă (diabetul zaharat tranzitoriu al nou-născutului), 7 maternă (sindrom Silver – Russell).

 

                1.5. ANOMALIILE CROMOSOMICE DOBÂNDITE

 

Anomaliile cromosomice dobândite se pot produce în celulele somatice, după naştere, sub acţiunea unor agenţi mutageni sau spontan, în anumite sindroame de instabilitate cromosomică sau în tumori şi leucemii.

Diferiţi agenţi mutageni,  substanţe chimice sau radiaţiile ionizante, pot determina rupturi cromatidiene (în G2) sau cromosomice (în G1) şi uneori cromosomi inelari, dicentrici, deleţii sau translocaţii; frecvenţa lor este proporţională cu intensitatea expunerii şi eficienţa mecanismelor de reparare.

Mai multe sindroame ereditare monogenice (sindromul Bloom,  anemia Fanconi, Ataxia-telangiectazia, sindromul Nijmegen, sindromul ICF, sindromul Roberts, Xeroderma pigmentosum) se caracterizează prin instabilitatea cromosomică. Bolnavii cu aceste afecţiuni prezintă, în culturi celulare (limfocite) de scurtă durată, un procentaj anormal de mare de rupturi cromosomice sau cromatidiene, schimburi de fragmente şi figuri triradiale sau cvadriradiale (ce atestă un crossing over somatic) sau alte defecte (instabilitate centromerică, separarea regiunilor de heterocromatină etc); de subliniat faptul că aceste modificări nu sunt clonale. Natura modificării cromosomice şi defectul molecular (în replicarea sau repararea ADN) care stă la baza ei sunt diferite în fiecare afecţiune. Majoritatea acestor sindroame au un risc crescut de cancerizare.

Celulele maligne pot prezenta diferite anomalii cromsosomice care nu există în ţesuturile neimplicate în procesul tumoral. Anomaliile cromosomice în tumori şi leucemii se pot clasifica în manifestări citologice ale amplificării genomice, anomalii clonale (care au adesea un caracter neîntâmplător) şi anomalii secundare.

§       Amplificările genomice se pot manifesta citologic fie prin cromosomi „double minutes” – cromosomi  minusculi, ce apar dedublaţi în metafază – fie prin segmente cromosomice colorate omogen (HSR- homogeneously staining region) sau anormal (ABR- abnormal banded region). Aceste modificări corespund unor segmente cromosomice în care anumite gene (oncogene) sunt multiplicate considerabil.

§       Anomaliile clonale sunt mai frecvente în anumite tipuri de neoplazii, fiind mai mult sau mai puţin specifice; de exemplu, t(15;17)(q22;q12) în leucemia acută cu promielocite sau deleţia 13q14 în retinoblastom. Dar specificitatea lor nu este absolută; de exemplu, translocaţia t(9;22)(q34:q11), ce corespunde cromosomului Philadelphia, era considerată specifică leucemiei mieloide cronice dar a fost descrisă şi în anumite leucemii acute. Cert este faptul că diferite tipuri de anomalii structurale, caracteristice unor neoplazii, produc o serie de modificări moleculare (dereglarea expresiei unor oncogene, formarea unor gene hibride, pierderea unor gene supresoare de tumori) implicate în etiopatogenia tumorală (vezi capitolul 17).

§       Anomaliile secundare (de număr şi/sau structură) apar în stadiile mai tardive şi invazive ale dezvoltării tumorale. Ele sugerează faptul că un element important al progresiei cancerului este alterarea unor gene implicate în menţinerea integrităţii şi stabilităţii cromosomilor şi în asigurarea segregării lor mitotice corecte.

 

2.       CONSECINŢELE  FENOTIPICE  ALE  ANOMALIILOR  CROMOSOMICE

 

În funcţie de consecinţele fenotipice, anomaliile cromosomice se pot împărţi în două mari categorii:

§       anomalii neechilibrate – în care de regulă se produce un plus sau un minus de material cromosomic şi fenotipul este anormal;

§       anomalii echilibrate – fără modificări cantitative de material genetic şi cu fenotip normal.

În prima categorie se încadrează, firesc, toate anomaliile numerice (poliploidiile, trisomiile, monosomiile) şi o parte din anomaliile de structură, cele neechilibrate (deleţiile, cromosomii inelari, duplicaţiile, isocromosomii), în care se produc trisomii (foarte rar tetrasomii) sau monosomii parţiale. În a doua categorie se includ translocaţiile reciproce echilibrate, inversiile şi inserţiile, care nu modifică cantitatea de material cromosomic. Această clasificare este relativă deoarece:

§       în translocaţiile Robertsoniene se pierd totuşi porţiuni din braţele scurte ale cromosomilor acrocentrici implicaţi, dar fenotipul ramâne normal întrucât segmentele pierdute conţin gene pentru ARN ribosomal (care se găsesc în cantitate suficientă pe braţele scurte ale celorlalţi acrocentrici);

§       uneori translocaţiile şi inversiile pot produce un fenotip anormal dacă punctele de ruptură alterează secvenţele codante sau reglatoare ale unor gene sau plasează unele gene într-o regiune cu heterocromatină inactivă;

§       disomiile uniparentale nu modifică cantitatea de material genetic dar pot determina, prin mecanismele precizate, un fenotip anormal.

 

2.1 CONSECINŢELE ANOMALIILOR CROMOSOMICE NEECHILIBRATE

 

Anomaliile cromosomice de număr sau structură neechilibrate sunt modificări cantitative ale materialului genetic, „anomalii de dozaj genic” întrucât informaţia genetică din cromosomii supranumerari sau modificaţi structural este calitativ normală. Pentru aceasta pledează faptul că indivizii fertili cu anomalii cromosomice numerice (de exemplu, femei cu trisomie 21 sau cu trisomie X) pot avea descendenţi normali. Fenotipul anormal este consecinţa unui exces (+ 50%) sau a unei lipse (-50%) de gene normale.

Dezechilibrul genetic, indiferent de tip, determină o serie de „semne comune” (Opitz, 1981): tulburări de creştere prenatală şi postnatală, dismorfie facială şi frecvent anomalii congenitale majore multiple, displazii, dermatoglife anormale, alterări ale structurii şi funcţiei SNC (întârziere în dezvoltarea psiho-motorie), tulburări ale funcţiei gonadale. Cunoaşterea lor poate orienta un diagnostic spre categoria „boli cromosomice”.

Gravitatea afectării fenotipice depinde de mai mulţi factori.

(1). Mărimea dezechilibrului genetic. Poliploidiile, trisomiile cromosomilor mari şi monosomiile autosomale sunt letale iar gravitatea trisomiilor autosomale viabile este proporţională cu mărimea cromosomului (tri 13 > tri 18 > tri 21).

(2). Tipul de anomalie.

§       Monosomiile sunt mai grave decât trisomiile şi sunt letale pentru toţi autosomii precum şi în cazul majorităţii monosomiilor X (sunt autori care consideră că cele mai multe din pacientele cu cariotip 45,X prezintă de fapt o monosomie X în mozaic 46,XX/45,X dar că linia normală lipseşte în limfocite)

§       Aneuploidile cromosomilor sexuali sunt mai puţin grave decât cele autosomale, datorită inactivării parţiale a cromosomilor X suplimentari.

(3). Conţinutul genic şi cantitatea de eucromatină / heterocromatină a cromosomului implicat. În acest context, se explică de ce trisomia 21 este mai puţin gravă decât trisomia 22 – ambii cromosomi fiind apropiaţi ca mărime, precum şi semnele specifice şi gravitatea diferită a unor trisomii parţiale pentru segmente identice ca dimensiune. Anomaliile ce interesează benzile R (pozitive) alcătuite din eucromatină sunt mai grave decât cele ce interesează benzile G (pozitive), bogate în heterocromatină.

(4) Numărul celulelor afectate. Aneuploidiile omogene sunt mai grave decât cele reprezentate de mozaicuri de celule anormale şi normale. Reamintim (vezi 5.B.2.3 şi 5.D.3.) că efectele fenotipice ale mozaicurilor cromosomice depind de:

§       momentul ontogenetic în care se produc (apariţie precoce – gravitate mai mare);

§       distribuţia clonelor în diferite ţesuturi (vezi mozaicism  limitat la placentă; mozaicurile germinale  sau clonele celulare ce produc cancer);

§       tipul cromosomului implicat (mozaicurile gonosomale sunt mai puţin grave decât cele autosomale.

 

     CONSECINŢELE ANOMALIILOR CROMOSOMICE ECHILIBRATE

 

Aşa cum am precizat mai sus, cu câteva excepţii, anomaliile cromosomice echilibrate – translocaţiile reciproce, inversiile şi inserţiile – determină un fenotip normal. Ele pot avea însă consecinţe reproductive serioase (vezi şi capitolul 10.A):

§       blocarea gametogenezei datorită sinapsei neobişnuite între cromosomii omologi, determinată de prezenţa anomaliei structurale;

§       producerea de gameţi anormali (figurile 6.28, 6.30 şi 6.31) care, după fecundare, determină formarea de embrioni cu monosomii şi/sau trisomii parţiale (complete în cazul translocaţiilor Robertsoniene); frecvent dezechilibrul cromosomic este important şi aceşti embrioni se elimină ca avorturi spontane.

S-a stabilit că la 3- 6% din cuplurile sterile sau cu avorturi spontane repetate unul sau altul din membrii cuplului prezintă o anomalie cromosomică echilibrată. În acest context să reamintim că una din 400 de persoane aparent sănătoase din populaţie are o translocaţie, 1: 1000 – o translocaţie Robertsoniană şi 1 : 1250 prezintă o inversie; deci, cel puţin 4 : 1000 de persoane sunt purtătoare de anomalii cromosomice echilibrate ce pot da tulburări de reproducere majore.

 

3.       FRECVENŢA  ŞI  CAUZELE  ANOMALIILOR  CROMOSOMICE

 

                Frecvenţa anomaliilor cromosomice la om este foarte mare comparativ cu alte specii. Deşi estimările efectuate pe diferite categorii de celule şi fenotipuri umane – de la gameţi, la nou născuţi şi adulţi (tabelul 6.6) – sunt dependente de metode şi loturi, iar datele actuale sunt foarte probabil subevaluări ale fenomenului real, se poate conchide – fără rezerve – că anomaliile cromosomice reprezintă o cauză importantă de morbiditate şi mortalitate.

Tabelul 6.6  Frecvenţele aproximative ale anomaliilor cromosomice în diferite populaţii

(excluzând deleţiile detectate prin FISH)

Populaţie

Frecvenţa anomaliilor (%)

Spermatozoizi (bărbaţi normali şi fertili)

≥ 10 (?)

Ovule               (femei normale şi fertile)

≥ 10 (?)

Toţi zigoţii

10 – 30

Embrioni în stadiul preimplantator

           (studii de fertilizare in vitro)

20 – 25

Sarcini recunoscute clinic (5 – 28 spt)

≥ 8

Avorturi spontane:

           Sarcini nerecunoscute clinic

                       (≤ 4 spt)

           Sarcini 5 – 8 spt

           Sarcini 9 – 12 spt

           Toate sarcinile recunoscute clinic

                       (5–28spt)

 

       

90 (?)

60

12 – 32

 ≥ 30 – 35

Nou născuţi morţi (≥ 28 spt)

5 – 6

Nou născuţi vii

   0.5 – 1

Decese neonatale şi la sugari

5 – 7

Pacienţi cu malformaţii congenitale

4 – 8

Pacienţi cu malformaţii cardiace

13

Retard mintal (excluzând X fragil)

           QI ≤ 20

           QI = 20 – 49

           QI = 50 – 69

3 – 35

3 – 10

   12 – 35

3

Alte tulburări de dezvoltare neuropsihică

1 – 3 (?)

Sindromul X fragil

0.4

Hermafroditism adevărat

25

Bărbaţi – defecte în diferenţierea sexuală

≤ 25

Femei – tulburări de dezvoltare pubertară

≤ 27

Deficienţă ovariană primară

65

Bărbaţi sterili

2 – 15

Cupluri cu ≥ 3 avorturi spontane

2 – 5

Surse: Hooket, 1992; Jacobs, 1992; Hassold et al, 1996;  Eichenlaub-Ritter, 1996;

Gardner şi Southerland, 1996; Chandley, 1997; Garber et al, 1997;  Hsu, 1998; Mange,  1999

 

Anomaliile cromosomice au fost detectate la:

§       circa 10% din gameţi, la persoane – bărbaţi şi femei – normale şi fertile;

§       3% din fetuşii de 10 săptămâni şi 2% din cei de 15-16 saptamâni;

§       50 – 60% din avorturile spontane precoce (15-25% din toate sarcinile);

§       10 % din nou născuţi morţi (1% din toate sarcinile);

§       0,7 – 1 % din nou-născuţi vii (> 1:120);

§       2% din sarcinile femeilor cu vârsta mai mare de 35 de ani în momentul concepţiei.

Incidenţa diferitelor tipuri de anomalii cromosomice la nou nascuţii vii este prezentată în tabelul 6.7. Se observă că anomaliile neechilibrate, numerice şi structurale la un loc, reprezintă aproape jumătate din totalul anomaliilor cromosomice şi, deci, numai 1 la 250 de nou născuţi au un fenotip anormal produs de un dezechilibru cromosomic. Faţă de alte studii epidemiologice mai vechi, surprinde frecvenţa mai mare a anomaliilor structurale (5 ‰ din nou născuţi şi 60 % din toate anomaliile cromosomice) şi în mod deosebit a anomaliilor echilibrate 4,30 ‰ sau 1 la 232 nou născuţi vii; acest fapt este firesc (anomaliile numerice produc mai frecvent un dezechilibru grav, letal) şi reflectă indiscutabil sporirea calităţii metodelor de analiză citogenetică. Cert este că datele cuprinse în tabelele 6.6 şi 6.7 sunt subestimări ale valorilor reale deoarece nu includ sindroamele cu microdeleţii identificabile prin FISH; numai sindromul velo-cardio-facial (del 22q11) are o frecvenţă sub 1:1000 nn fiind probabil a doua anomalie cromosomică ca frecvenţă, după sindromul Down.

 

Tabelul 6.7  Incidenţa anomaliilor cromosomice la nou-născuţi

                       (Hook, 1992)

Tipuri de anomalii

Frecvenţă

Triploidii

0,02

Trisomii autosomale

    Trisomie 13

    Trisomie 18

    Trisomie 21

1,40

0,08

0,15

1,20

Aneuploidii gonosomale la băieţi

    47,XXY

    47,XYY

    altele

2,75

1,00

1,00

0,75

Aneuploidii gonosomale la fete   

     45,X şi 45,X/46,XX

     47,XXX

     altele

1,80

0,30

1,10

0.37

Anomalii structurale echilibrate

    

     Translocaţii reciproce

     Translocaţii Robertsoniene

     Inversii

4,30

(1/232)

2,50

1,00

0,80

Anomalii structurale neechilibrate

0,70

Anomalii cromosomice neechilibrate 

     (numerice şi structurale)

4,00

 (1/250)

TOTAL anomalii cromosomice

8,30

(1/120)

 

Datele actuale despre frecvenţa anomaliilor cromosomice reprezintă un motiv în plus pentru a studia cauzele şi mecanismele patogenice cu scopul de a identifica posibile intervenţii profilactice. Din păcate, în acest domeniu nu s-au înregistrat  elemente noi. Este cert doar faptul că etiopatogenia anomaliilor numerice diferă de cea a nomaliilor structurale.

                Cauzele aneuploidiilor produse prin erori de distribuţie (nedisjuncţie, pierdere anafazică) sunt încă neelucidate. Singura certitudine este asocierea dintre vârsta maternă crescută în momentul concepţiei şi incidenţa mare a trisomiilor la copii. Cel mai clar efect al vârstei materne a fost dovedit în sindromul Down (trisomia 21) dar efecte similare au fost identificate şi în cazul trisomiilor 13 şi 18. În locul graficelor şi tabelelor care ilustrează în literatura de efectul vârstei materne asupra frecvenţei naşterilor cu trisomii autosomale, preferăm să subliniem că riscul de nedisjuncţie este:

§       1 la 1000 pentru femeile gravide în vârstă de ≤ 25 de ani;

§       1 la 100 la vârsta de 37 de ani;

§       1 la 10 la vârsta de 45 de ani

La aceste date mai adăugăm faptul că 92% din cazurile de trisomie 21(cea mai frecventă boală cromosomică) sunt produse prin nedisjuncţie maternă în meioza I. Efectul vârstei materne, ca factor predispozant la nedisjuncţie, este sigur şi – foarte probabil – vîrsta se corelează cu particularităţile meiozei materne[21], care (printre altele) blochează ovocitele timp de câteva decade în profaza meiozei I („ovulele au vârsta femeii”). Studiile de genetică moleculară au permis formularea a trei ipoteze despre cauzele primare ale nedisjuncţiei, corelată cu vîrsta maternă:

§       sinapsa prelungită între cromosomii omologi în meioza I (datorită recombinărilor intracromsomice localizate exclusiv centromeric sau telomeric) „trage” ambii cromosomi în aceeaşi celulă fiică;

§       separarea precoce a cromatidelor surori (în M II) ca o consecinţă, probabilă, a reducerii ratei recombinărilor intracromosomice;

§       anomalii ale fusului de diviziune.

Nedisjuncţia are probabil şi alte cauze decât vârsta maternă reproductivă avansată, deoarece numai 25% din cazurile de sindrom Down se nasc din femei peste 35 de ani. În ciuda cercetărilor intense, nu există nici-o dovadă ştiinţifică care să susţină rolul posibil al unor factori externi (infecţii virale, radiaţii, medicamente, hormoni, contraceptive, cafea sau fumat, reducerea frecvenţei raporturilor sexuale etc. De asemenea,  la om este foarte probabil că nu intervin factori genetici (mutaţii ale unor gene ce controlează disjuncţia). Totuşi nu trebuie să uităm că la alte specii nedisjuncţia este sub control genetic iar la om diferiţi cromosomi au rate diferite de trisomie în avorturile spontane (de exemplu, trisomia 16 reprezintă o treime din aceste avorturi). Oricum, controlul genetic al meiozei este încă departe de a fi elucidat

Cauzele anomaliilor cromosomice de structura par la prima vedere mai clare deoarece mecanismul lor clasic de producere implică ruperea cromosomilor şi reunirea anormală a capetelor cromosomilor rupţi. Deci agenţii ce rup cromosomii (numiţi şi „clastogeni”) sunt cauzele primare ale anomaliilor structurale. În realitate, se acumulează continuu dovezi care arată ca intervenţia clastogenilor este minimă iar cele mai multe anomalii structurale, din celulele germinale sau somatice, se produc spontan foarte probabil prin erori de recombinare, fie prin recombinarea omologă nealelică sau ectopică (împerecherea incorectă a omologilor produce un crossing over inegal) fie prin recombinare neomologă (sinapsă între regiuni identice din cromosomi  neomologi). În aceste condiţii, structura particulară a genomului uman pare a fi  sursa principala a erorilor de recombinare si deci a anomaliilor structurale.

Revenim astfel la prima idee a acestei secţiuni; chiar dacă 95 % din produţii de concepţie anormali sunt eliminaţi ca avorturi spontane, rata anomaliilor cromosomice la nou născuţii vii (> 1:120) este mai mare decât la alte specii. De ce ? Nu există explicaţii clare pentru această situaţie; exceptând efectul vârstei materne, se poate spune că nu există, foarte probabil, factori genetici şi de mediu care să fie implicaţi semnificativ în producerea anomaliilor cromosomice. Poate că frecvenţa lor ridicată reprezintă „preţul pe care îl plătim pentru ceea ce am ajuns”, pentru evoluţia noastră la Homo sapines sapiens, evoluţie care a generat anumite particularităţi structurale şi funcţionale ale genomului uman. „Cert este că medicii şi publicul trebuie să se obişnuiască cu ideea că un anumit grad al  perturbării  reproducerii umane prin anomalii cromosomice este…normal, iar eliminarea unui fetus anormal cromosomic este o selecţie naturală…binevenită” (Dorothy Warburton, 1997).

 

                D. POLIMORFISMELE GENETICE

 

Două genomuri umane alese la întâmplare sunt identice între ele în proporţie de 99,9%. Restul de 0,1% conţine variante genetice sau versiuni diferite (alele) ale unei secvenţe de ADN, situată într-o anumită poziţie (locus) din cromosomi, şi care ar rezultat în urma unor mutaţii. Când anumite variante genetice – alele – sunt frecvente şi se găsesc la mai mult de 1 % din populaţia generală, atunci ele se constituie ca polimorfisme genetice. În contrast, alelele cu o frecvenţă mai mică decât 1% sunt numite, prin convenţie, variante rare. Aceste denumiri au fost alese pentru a permite diferenţierea lor de mutaţii, termen care implică per se un efect negativ asupra proteinei şi, respectiv, asupra caracterului fenotipic corespunzator, deşi mecanismul de producere este similar. In prezent exista tendinţa unificării tuturor acestor termeni sub denumirea largă de variante genetice.

Polimorfismele genetice sunt responsabile pentru cea mai mare parte din diversitatea şi individualitatea fenotipică observată în cadrul speciei umane. Aceste variaţii genetice pot fi localizate oriunde în genom, atât în interiorul genelor, cât şi în regiunile intergenice. Evident, numai acele polimorfisme existente la nivelul genelor au potenţialul de a asocia modificări fenotipice. De aceea, primele polimorfisme genetice au fost identificate indirect, prin studiul variaţiilor existente la nivelul proteinelor codificate. Ulterior a devenit însă clar că acest fenomen este mult mai amplu, deoarece toate polimorfismele rezultă, în ultimă analiză, prin modificări în secvenţa ADN. Dincolo de interesul teoretic, mai ales în studiile de genetică populaţională (vezi capitolul 7), identificarea sistematică a polimorfismelor umane s-a dovedit a avea numeroase aplicaţii practice; vom menţiona doar utilizarea lor

§       în transfuzii sanguine şi transplante,

§       identificarea de persoane,

§       stabilirea paternităţii,

§       diagnosticul genotipic indirect prin folosirea unor markeri genetici.

 

1.        POLIMORFISME PROTEICE

 

Primele informaţii privind diversitatea genetică dintre indivizii umani au fost obţinute prin studiul variantelor proteice existente în populaţie. Primele polimorfisme au fost identificate încă de la începutul secolului trecut prin analiza aşa-numitelor antigene de grup sanguin, precum cele din sistemele ABO şi Rh. Ulterior au fost evidenţiate şi alte polimorfisme antigenice, prin studiul unor sisteme mai rare de grup sanguin (MNSs, Lutheran, Lewis, Xg etc) şi, mai recent, a sistemului HLA, considerat cel mai polimorfic sistem genetic uman (vezi capitolul 16). Prin studiul mobilităţii electroforetice, activităţii enzimatice şi a diferitelor  proprietăţi fizico-chimice s-a evidenţiat polimorfismul unor proteine serice (haptoglobina, transferina, alfa-1-antitripsina, imunoglobulinele, ceruloplasmina etc), al unor enzime eritrocitare (fosfatza acidă-1, G6PD, esteraza D, fosfoglucomutaze), serice (colinesteraza-1, TGP, etc), tisulare (alcool dehidrogenaza, acetil-transeraza hepatică, etc)

A devenit astăzi clar că doi indivizi aleşi la întâmplare din populaţia generală pot prezenta diferenţe structurale la nivelul a circa 20% din totalul proteinelor. Cu cât indivizii sunt mai îndepărtaţi din punct de vedere genetic (grupuri etnice diferite), cu atât gradul de diversitate este mai pronunţat. Toate  sistemele genetice  polimorfice se găsesc în populaţie în mai multe variante; un individ posedă însă numai o anumită variantă dintr-un sistem. Datorită numărului mare de sisteme polimorfice (>30) si de variante în fiecare sistem, se pot realiza un număr imens de combinaţii şi fiecare individ posedă o combinaţie specifică de variante, este un unicat biologic. Se poate presupune firesc faptul că fiecare persoană de pe această planetă (exceptând gemenii monozigoţi) are o structură genetică unică. Aceste date au demonstrat fără echivoc conceptul de "individualitate chimică" emis de către Sir Archibald Garrod cu un secol în urmă. Înţelegerea individualităţii genetice şi biologice este piatra fundamentală a abordării genetice în medicina practică, exprimată prin dictonul: “nu există boli ci numai bolnavi”.                Având în vedere valoarea istorică cât şi valoarea practică deosebită, vom prezenta, succint, în continuare câteva elemente care stau la baza diversităţii sistemelor de grup sanguin ABO şi Rh şi a proteinei serice alfa1-antitripsină.

 

                1.1. Polimorfismul sistemulului de grup sanguin ABO

               

Sistemul de grup sanguin ABO a fost descris pentru prima dată de către Landsteiner în 1900 iar premiul Nobel pe care l-a primit se justifică prin rolul major pe care îl are sistemul ABO în transfuziile de sânge şi transplanturile de organe.

Landsteiner a descris patru "tipuri" de sânge la om determinate de prezenţa pe suprafaţa eritrocitelor a antigenelor A şi B şi a anticorpilor corespunzători anti-A şi anti-B în ser. Există patru fenotipuri majore: O, A, B şi AB: tipul A este caracterizat prin prezenţa antigenelor A şi a anticorpilor anti-B, tipul B prin prezenţa antigenelor B şi a anticorpilor anti-A, tipul AB prin prezenţa ambelor antigene şi absenţa celor doi anticorpi, iar tipul O prin absenţa antigenelor şi prezenţa celor doi anticorpi. Datorită acestui tip de corelaţie între antigene şi anticorpi, transfuziile de sânge se recomandă a se efectua numai izogrup.

                Bazele moleculare ale  sistemului de grup ABO au început a fi înţelese relativ recent. Antigenele de grup ABO sunt de fapt molecule de glicoproteine care sunt ataşate la suprafaţa eritrocitară. Ceea ce determina diferenţa dintre antigene este nu componenta proteică, care este relativ identică, ci o serie de grupări glucidice ataşate (vezi capitolul 4.B.5. şi figura 4.11). Prima etapă în formarea acestor antigene este rezultatul intervenţiei unei enzime numită fucozil transferaza (codificata de gena FUT1 localizată pe cromosomul 19) care determină adiţia unor grupări de fucoză la miezul proteic. Rezultatul acestei etape este formarea antigenului H. Etapa a doua este catalizată de enzima glicozil transferaza (codificată de gena ABO de pe cromosomul 9) care prezintă în populaţia generală doua variante alelice majore, codominante, A şi B şi o variantă recesivă, O. Varianta alelică A determină adiţia la antigenul H a unui rest de N-acetilgalactozamină, cu formarea antigenului A, în timp ce varianta alelică B are afinitate mai crescută pentru adiţia unui rest de D-galactoză, ceea ce transformă antigenul H în antigen B. La persoanele de grup sanguin O glicozil transferaza nu este funcţională şi, ca urmare, eritrocitele vor prezenta pe suprafaţa lor antigene H.

Au fost identificate şi persoane care prezintă mutaţia homozigotă a genei FUT1. Aceşti indivizi nu sunt capabili să realizeze prima etapă în formarea antigenelor de grup ABO şi, ca urmare, indiferent că din punct de vedere genetic prezintă sau nu alele A şi/sau B ale glicozil transferazei, ele nu vor putea conduce la formarea antigenelor A şi B (fenotip Bombay). Aceşti indivizi prezintă în ser anticorpi anti-A şi anti-B şi, ca urmare, din punct de vedere serologic nu pot fi diferentiaţi de indivizii cu grup O. Analiza genetică a indivizilor cu grup Bombay a evidenţiat aspectul omogen, cu prezenţa aceleiaşi mutaţii punctiforme T725G care inactivează FUT1, asociată cu deleţia genei invecinate FUT2 care este responsabilă de secreţia antigenelor de grup sanguin în salivă (caracterul secretor).

Odata cu clonarea genei glicozil transferazei a putut fi analizat substratul molecular al diferenţelor care există între alelele A, B şi O. Între secvenţa alelelor A şi B există o diferenţă de patru nucleotide care produc modificări de secvenţă a aminoacizilor ce modifică specificitatea glicozil transferazei codificată de gena ABO. Alela O are deleţia unei perechi de baze care produce o mutaţie cu schimbarea cadrului de lectură ce suspendă activitatea transferazei mutante. Deci micile modificări genetice conduc la substituţia unor aminoacizi din structura enzimei, care vor determina modificarea afinităţii pentru resturile glucidice. In fapt au fost evidenţiate numeroase subgrupuri sanguine precum A2, Ax sau B3 determinate de asemenea de diferenţe genetice la nivelul regiunilor codante şi producerea a peste 70 de alele. Se adaugă şi variaţii genetice la nivelul regiunilor reglatorii 5' si 3' precum şi numeroase variaţii genetice la nivelul intronilor.

 

1.2. Polimorfismul sistemului de grup sanguin Rh

 

Denumirea sistemului Rh provine de la maimuţele Rhesus care au fost utilizate în experimentele ce au dus la descoperirea sistemului de către Diamond şi Blackfan în 1932. Sistemul Rh este important pentru rolul sau în transfuziile de sânge şi în boala hemolitică a noului născut. Din punct de vedere fenotipic populaţia generală este împărţită în două categorii majore: indivizi Rh pozitivi care exprimă pe suprafaţa eritrocitelor antigenul RhD (aproximativ 85% din populaţia caucaziană) şi indivizi Rh negativi care nu exprimă acest antigen (15%). Spre deosebire de sistemul ABO indivizii Rh negativi nu prezintă spontan anticorpi anti RhD în ser. În schimb, aceşti anticorpi se pot dezvolta ca urmare a contactului cu sângele Rh pozitiv care determină imunizarea invivizilor respectivi. Acest proces are o semnificaţie deosebită în cazul transfuziilor de sânge şi în cazul bolii hemolitice a nou-născutului.

Boala hemolitică a nou-născutului este o afecţiune care poate apărea la copii Rh pozitivi născuţi din mame Rh negative. În mod normal, în cursul sarcinii, mici cantităţi de sânge fetal pot traversa bariera placentară determinând imunizarea mamei Rh negative. Anticorpii materni necesită un interval de timp pentru formare, astfel încât, de regulă, prima sarcina decurge fără probleme. Atunci când mama a fost imunizată anterior primei sarcini, sau în cursul unei a doua sarcini cu feţi Rh pozitivi, anticorpii anti RhD de la mamă pot traversa bariera placentară către făt, în special spre sfârşitul sarcinii, determinând hemoliza eritrocitelor fetale. Rezultatul este icterul pronunţat şi, în formele severe, insuficienţa cardiacă congestivă. Afecţiunea poate fi prevenită în prezent prin administrarea la femeile Rh negative de imunoglobuline împotriva anticorpilor anti-RhD după fiecare sarcină cu făt Rh pozitiv.

                                Studiile de genetică au evidenţiat faptul că sistemul Rh este unul dintre cele mai polimorfice sisteme de grup sanguin, cu peste 45 de antigene independente. Există trei gene majore care sunt implicate în producerea acestui sistem: gena RHD ce codifică proteina RhD (purtătoare a antigenului RhD) şi gena RHCE care codifică proteina RhCcEe (purtătoare a antigenelor C sau c si E sau e) sunt localizate pe braţul scurt al cromosomului 1, în timp ce gena RHAG (Rh associated glycoprotein) este localizată pe cromosomul 6p. Proteinele Rh poartă antigenele Rh, dar sunt exprimate pe suprafaţa eritrocitelor numai dacă proteina RhAG este de asemeni prezentă. La toate acestea se adaugă şi o serie de proteine Rh accesorii şi toate împreună formează "complexul Rh". Indivizii Rh pozitivi prezintă antigenul major al acestui sistem, RhD. Indivizii Rh negativi prezintă de regulă o deleţie a întregii gene RHD. În schimb, diferenţele care există între alelele C şi c, respectiv E şi e sunt rezultatul unor polimorfisme mononucleotidice care conduc la substituţia unor aminoacizi în structura proteinei RhCcEe.

 

1.3     POLIMORFISMUL ALFA1 –ANTITRIPSINEI.

 

Alfa1-antitripsina este o proteinã sericã importantã cu acţiune inhibitoare asupra unor enzime proteolitice specifice cum sunt: tripsina, chimotripsina sau elastaza pancreaticã. Ţinta sa principalã este elastaza leucocitarã, enzimã care în lipsa inactivãrii de cãtre alfa1-antitripsinã, distruge proteinele ţesutului conjunctiv pulmonar, în special elastina, determinând dezorganizarea alveolelor pulmonare. Deficienţa în alfa1-antitripsinã produce o formă severă de emfizem pulmonar (boală pulmonară cronică obstructivă), cu debut precoce.

Locusul genei care codificã alfa1-antitripsina, cunoscut sub numele de PI (protease inhibitor) este situat la nivelul cromosomului 14[A1]  şi prezintã un înalt polimorfism. Unele variante alelice sunt mai frecvente în populaţie (10-75%), altele mai rare. Cele mai frecvente alele (M1, M2, M3) codificã variante proteice diferite structural dar cu funcţie normalã. Alte alele rare (Z şi S) specificã variante proteice cu activitate inhibitorie proteazicã semnificativ redusã, ceea ce duce la apariţia unor manifestãri clinice.

Principala semnificaţie medicalã a polimorfismului alfa1-antitripsinei este legatã de alelele care determinã o deficienţã în sinteza şi activitatea acestei proteine. Cea mai importantã dintre acestea este alela Z, având o frecvenţã de 1-2% în populaţie. Indivizii cu genotip Z/Z prezintã o concentraţie plasmaticã mult mai redusã (circa 15%) şi un risc crescut de boalã pulmonarã obstructivã, instalatã la adultul tânãr, astm bronşic, ciroză hepatică[22]. Deficienţa alfa1-antitripsinei prezintã frecvenţe diferite în populaţie, de la aproximativ 1/2000 – 1/8000 în populaţia caucazianã la frecvenţe mult mai reduse în populaţia de culoare şi la asiatici. Şi alte variante genotipice, cum ar fi statusul heterozigot pentru alelele S sau Z pot avea semnificaţie clinicã, determinand predispoziţie pentru afectare pulmonarã mai ales la fumãtori.

 

2. Polimorfisme  ADN

 

Dupa cum am precizat anterior, analiza la nivel proteic permite identificarea numai a unei minorităţi a polimorfismelor genetice şi anume a acelora care determină modificarea secvenţei aminoacizilor. Însă în interiorul genelor există “variaţii genetice sinonime”, care nu pot fi identificate pe baza modificărilor fenotipice. În plus, variaţii de secvenţă nucleotidică a unor segmente/regiuni de ADN există şi în regiunile intergenice iar frecvenţa acestor polimorfisme intergenice o depăşeste de regulă pe cea din interiorul genelor, deoarece în acest caz nu există nici o presiune de selecţie. Există mai multe tipuri de polimorfisme ADN. Cea mai simpla formă este reprezentată de polimorfismele mononucleotidice (SNP – single nucleotide polymorphism). Acestora li se adaugă polimorfismele existente la nivelul unor repetiţii nucleotidice simple (de la unul până la şase nucleotide) care intră în componenţa microsateliţilor sau polimorfismele prezente la nivelul minisateliţilor.  Toate aceste tipuri de variaţii în secvenţa ADN se corelează cu polimorfismul lungimii fragmentelor de restricţie

 

2.1 POLIMORFISMUL LUMGIMII FRAGMENTELOR DE RESTRICţIE

 

Enzimele de restricţie (vezi capitolul 3.C.1.1) recunosc o secvenţă nucleotidică specifică şi secţionează ADN la acest nivel. Clivarea moleculei de ADN cu o anumită enzimă de restricţie "fragmentează" ADN într-un număr definit de fragmente, de o anumită lungime, corespunzătoare distanţei dintre două situsuri de restricţie. Modificările de secvenţă nucleotidică care vor produce abolirea unui situs de restricţie, crearea unui situs nou sau schimbarea “distanţei” dintre două situsuri (prin deleţie sau inserţie nucleotidică) vor modifica lungimea fragmentelor de restricţie (acestea sunt evidenţiate prin Southern blot, după hibridarea cu o sondă corespunzătoare unei părţi din fragmentul respectiv, vezi 3.C.3.1) (figura 6.35). Aceste variaţii ale ADN au fost numite polimorfisme ale lungimii fragmentelor de restricţie – RFLPs (de la restriction fragment length polymorphisms; se pronunţă “reflips”). Fragmentele de lungimi diferite constituie alele codominante ale locusului ADN respectiv. În practică, RFLPs se folosesc în diagnosticul genotipic indirect deoarece anumite alele ale unui locus marker se pot transmite strâns înlănţuite cu o alelă mutantă (vezi capitolul 9).

 

2.2 Polimorfismele mononucleotidice (SNP)

 

SNP reprezintă forma cea mai frecventă a polimorfismelor ADN (în medie 1 la 1000 baze, dar frecvenţa poate fi mai înaltă în anumite regiuni precum insulele CpG – 1 la 100 sau mai redusă în interiorul unor gene – 1 la 2500 baze). SNP situate în regiunile intergenice sau cele sinonime din cadrul genelor nu sunt supuse selecţiei naturale. Pe de altă parte, modificarile nonsinonime pot fi supuse unor asemenea efecte, iar persistenţa lor în populaţie poate reflecta o serie de avantaje selective şi poate explica o bună parte din diversitatea fenotipică existentă în populaţia umană. Având în vedere acest fapt s-au depus eforturi considerabile pentru cartografierea şi caracterizarea acestor polimorfisme.

In anul 2001 o serie de organizaţii publice şi private precum Celera Genomics, Incyte Genomics, Sanger Institute şi Washington University au iniţiat un proiect comun de realizare a unei hărţi a acestor SNP la nivelul întregului genom. La aceasta s-au adaugat eforturile International SNP Map Working Group (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/) care au condus la identificarea până în prezent a cira 3 milioane SNP.

Există numeroase metode de identificare a SNP. Cu valoare istorică se poate menţiona tehnica RFLP care permite evidenţierea efectului indirect pe care asemenea SNP îl pot avea asupra unor situsuri de restricţie ale enzimei utilizate (apariţia sau anularea unor situsuri de restricţie determină lungimi diferite ale fragmentelor ADN în urma digestiei ADN genomic cu o enzimă de restricţie). Utilizarea enzimelor de restricţie permite însă acoperirea unei mici părţi (sub 5%) din întreaga secvenţă a ADN uman şi, de aceea, a fost necesară dezvoltarea unor tehnici noi, precum electroforeza in gel cu gradient denaturant (DGGE), analiza heteroduplexurilor, microcipuri şi secvenţializarea.

Studiul SNP este utilizat în prezent în câteva direcţii majore:

§       Localizarea genelor de susceptibilitate pentru caracterele multifactoriale (vezi tabelul 6.8) bazată pe studii de dezechilibru ale înlănţuirii şi studii de asociere a haplotipurilor (vezi capitolul 3.D).

Tabelul 6.8 Exemple de boli asociate cu unele SNP

Boala

Gena

Proteina codificata

  Astmul bronsic

EDN1

NOS1

  Endotelina 1

  Nitric oxid sintetaza 1

  Aritmiile cardiace

KCNQ1

  Proteina canal de potasiu

  Artrita idiopatică

MIF

  Factorul de inhibare a macrofagelor

  Cancerul pulmonar

MMP1

  Metaloproteinaza matriceala 1

  Ciroza biliară

MBL

  Proteina de legare a manozei

  Diabetul zaharat tip II

STX1A

  Sintaxina 1A

  Hipertensiunea arterială

TAF1

  Inhibitorul fibrinolizei activat de trombina

  Lupusul eritematos sistemic

PRL

  Prolactina

  Migrena

INSR

  Receptorul insulinic

 

§       Farmacogenetica care încearcă sa individualizeze tratamentul fiecarui pacient în funcţie de individualitatea sa genetică. Un rol major în aceste studii îl are în special identificarea şi înţelegerea efectelor pe care asemenea SNP le au asupra modularii activităţii enzimelor implicate în metabolizarea medicamentelor.

§       Cercetarile privind evoluţia speciei umane din punct de vedere biologic (similitudinea cu alte specii) şi istoric (migraţia populaţiilor).

 

                2.3 POLIMORFISMELE MICROSATELIŢILOR ŞI MINISATELIŢILOR ADN

               

Aceste polimorfisme ADN au fost prezentate deja în capitolul 2.C.

Minisateliţii (numiţi şi VNTR – variable number of tandem repeat) sunt reprezentaţi de multiple copii (ale unei secvenţe de 10-100 nucleotide, numită minisatelit) care sunt dispuse în tandem, între două situsuri de restricţie. Unii minisateliţi sunt extrem de polimorfici, putând prezenta în populaţia generală câteva zeci de alele, diferite prin numărul de repetiţii şi deci mărimea fragmentului de restricţie în care se află minisatelitul.

Deoarece secvenţa de bază (“miezul”) a unui minisatelit poate fi adeseori destul de asemănătoare la nivelul a numeroşi loci, aceasta a permis dezvoltarea unor tehnici care fac posibilă analiza simultană a mai multor loci folosind o singură sondă. Se realizează un model de distribuţie caracteristic unei anumite persoane, cunoscut sub numele de amprenta ADN (DNA fingerprinting). În principiu ADN genomic este supus digestiei cu o enzima de restricţie după care este utilizată metoda Southern blot în care un fragment minisatelitic este utilizat drept sondă (vezi figura 6.35).

Microsateliţii reprezintă secvenţe repetitive simple, cele mai frecvente forme fiind repetiţiile dinucleotidice, trinucleotidice şi tetranucleotidice care apar în medie cu o frecvenţă de 1 la fiecare 10 kb. Microsateliţii umani au un grad crecut de polimorfism, cu circa 10 alele diferite per locus în populaţie, ceea ce face ca gradul de heterozigozitate pentru majoritatea acestora să depăşească 80%. Această caracteristică a permis utilizarea lor în alcătuirea primelor hărţi genomice. De asemenea înlănţuirea genetică a unor microsateliţi cu o anumită genă este utilizată pentru diagnosticul indirect al purtătorilor unor mutaţii cauzatoare ale unor boli genetice.

 

                2.4. APLICAŢIILE PRACTICE MEDICALE A POLIMORFISMELOR ADN

 

                Polimorfismele genetice sunt amplu folosite în toate cercetările de genetică medicală deoarece permit diferenţierea diferitelor alele ale unei gene sau a diferitelor segmente de ADN genomic. Calitatea de markeri genetici a fost utilizată pentru cartografierea genică prin analize de înlănţuire, diagnosticul prenatal sau presimptomatic al unor boli genetice,depistarea heterozigoţilor purtători de gene recesive, identificarea persoanelor cu risc crescut sau scăzut pentru anumite boli comune ale adultului, tipare tisulară pentru transplante de organe, teste de paternitate, identificare persoanelor.

 

 

INTERNET

 

1.        Anomaliile cromosomice constituţionale: http://www.pathology.washington.edu:80/Cytogallery

2.        Bază de date privind cromosomii umani: http://www.kumc.edu/gec/geneinfo.html

3.        Bază de date pentru mutaţiile umane: HUGO database: http://www.ariel.ucs.unimelb.edu.au

                 Institute of Medical Genetics in Cardiff: http://www.archive.uwcm.ac.uk.

4.        Citogenetică moleculară: http://bioserver.uniba.it/fish/Cytogenetics/welcome.html

5.        Genetică medicală – http://www.hslib.washington.edu-helix

6.        Genetică medicală – University of Utah School of Medicine: http://medgen.genetics.utah.edu

7.        Gene amprentate; http://www.mgu.har.mrc.ac.uk/imprinting

8.        National  Human Genome Research Institut: http://www.nhgri. nih.gov.

9.        Nomenclatura mutaţiilor: http://www.gene.ucl.ac.uk/nomenclature/ 

10.     Nomenclatura genelor: http://www.gene.ucl.ac.uk/cgi-bin/nomenclature/searchgenes.pl

11.     Polimorfismele SNP: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/

12.     Structura normală şi anomaliile cromsoomice: http://www.tokyo~med.ac.jp

 

Bibliografie specifică  selectivă

 

  1. Antonarakis S.E. – Recommendations for a nomenclature system for human gene mutations- Hum.Mutat. 1998;11:1-3

2.        Avent N.D., Reid M.E – The Rh blood group system – Blood, 2000;95: 375-387.

  1. den Dunnen, J.T. and Antonarakis, S.E.- Mutation nomenclature extensions and suggestions to describe complex mutations: a discussion – Hum. Mut. 2000;15:7-12.
  2. D'Andrea A.D., Grompe M. – The Fanconi anaemia/BRCA pathway – Nat Rev Cancer, 2003, 3:23-34.
  3. Bishop A. J.R., Schiestl R.H. – Homologous recombination as a mechanism for genome rearrangements: environmental and genetic effects – Hum. Mol. Genet., 2000;9,2427-2434
  4. Dasika G. K. et al. –  DNA damage-induced cell cycle checkpoints and DNA strand break repair in development and tumorigenesis –  Oncogene, 1999;18:7883-7899
  5. Engel E. – Uniparental disomy, genomic imprinting and a case for new genetics – Ann.Genet, 1997;40:24-34
  6. Haber J. E. – Partners and pathways: repairing a double-strand break – Trends Genet.,  2000;16:259-264.
  7. Harfe B. D., Jinks-Robertson S. – DNA mismatch repair and genetic instability – Annu. Rev. Genet., 2000;34:359-399
  8. Hendrickson  E.A. – Cell-Cycle Regulation of Mammalian DNA Double-Strand-Break Repair – Am.J.Hum.Genet 1997;61:795-800.
  9. Hoeijmakers J.H. – Genome maintenance mechanisms for preventing cancer –  Nature, 2001;411:366-374.
  10. Inoue, K. and Lupski, J.R. – Molecular mechanisms for genomic disorders – Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 2002;3:199-242.
  11. Jeffrey A.J. – DNA typing: approaches and applications – J.Foresnic Sci.Soc. 1993;33:204-211
  12. Kazanian H.H, Moran J.V. – The impact of L 1 retrotransposons on the human genome – Nature Gen. 1998; 19:19-23
  13. Khanna K. K. – Cancer Risk and the ATM Gene: a Continuing Debate – J. Natl. Cancer Inst., 2000;92: 795-802
  14. Latchman D.S. – Transcription-factor mutations and disease –  N.Engl.J.Med 1996; 334:28-33.
  15. Ledbetter DH, Ballabio A. – Molecular Cytogenetics of contiguous gene syndrome – in Scriver CR, Beaudet AL, Sly WS, Valle D (eds) – The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Diseases, 7th ed, McGraw-Kill, 1995, New York, pp811-839
  16. Lindahl T., Wood R. D. – Quality Control by DNA Repair – Science, 1999;286:1997-2005
  17. Lupski JR. – Genomic disorders: structural features of the genome can lead to DNA rearrangements and human disease traits – Tends Genet. 1998;14:417-422
  18. Minnick D.T., Kunkel  T.A. – DNA synthesis errors, mutators  and cancer  - Cancer Survey, 1996;28: 3-20.
  19. Peltomaki P. – Deficient DNA mismatch repair: a common etiologic factor for colon cancer – Hum.Mol.Genet., 2001;10:735-740
  20. Petes T.D. – Meiotic recombination: hot spots and cold spots – Nat. Rev. Genetics, 2001;2: 360-369
  21. Petronczki M, Simos MF, Nasmyth K- Un menage a quatre: the molecular biology of chromosome segregation in meiosis – Cell, 2003;112: 423-440
  22. Preston J.R. – Aneuploidyin germ cells: disruption of chromosome mover components – Env.Mol.Mutagenesis 1996;28:176-181
  23. Richards, R.I. – Dynamic mutations: a decade of unstable expanded repeates in human genetic disease-  Hum. Mol. Genet. 2001;10: 2187-2194.
  24. Roeder G.S.-  Meiotic chromosomes: it takes two to tango – Genes Dev., 1997;11: 2600-2621
  25. Sancar  A. – DNA Repair in humans  - Annu.Rev. Genetics, 1995;29:69-105.

28.     Shastry B.S. –  SNP alleles in human disease and evolution – J. Hum. Genet., 2002;47: 561-566.

  1. Vidau M. – Mécanismes et conséquences des mutations génétiques – Rev Prat. 1997; 47:146-154.
  2. Zhou B. B. S., Elledge S. J. – The DNA damage response: putting checkpoints in perspective – Nature, 2000;408:433-439
  3. Wang DG, Fan J, Siao C et al – Large-scale identification, mapping and genotyping of single-nucleotid polymorphisms in the human genome – Science, 1998;280:1077-1082
  4. Weaver  D.T. – Regulation and repair of double-strand DNA breaks – Critical Rev.Eukar.Gene Expression , 1996, 6:345-375
  5. Wheeler J. M. D., Bodmer W. F., Mortensen N.J. – DNA mismatch repair genes and colorectal cancer – Gut, 2000;47:148-153

34.     Yip S.P. – Sequence variation at the human ABO locus – Ann. Hum. Genet., 2002;66:1-27.

  1. Youssoufian, H. and Pyeritz, R.E. – Mechanisms and consequences of somatic mosaicism in humans –  Nat. Rev. Genet. 2002;3: 748-758.



[1] Codul cu o literă: A-alanina, C-cisteina, D-acidul aspartic, E.acidul glutamic, F-fenilalanina, G-lizina, H-histidina, I-isoleucina, K-lizina, M-metionina, N-asparagina, P-prolina, Q-glutamina, R-arginina, S-serina, T-treonina, V-valina, W-triptofanul, Y-tirozina; X-semnifică un codon stop.

 

[2] În unele boli, din motive neclare, această probabilitate creşte considerabil; de ex. în acondroplazie mutaţia CpG din gena pentru FGFR3 este de cel puţin 100 de ori mai frecventă decât cea interesând alte dinucleotide.

[3] Efectul depinde de poziţia codonului stop, la începutul genei mai grav decât în regiunea terminală a genei.

[4] S-a stabilit prin convenţie (1993) că nomenclatura tripletelor repetitive să se facă în ordinea alfabetică a bazelor azotate şi în direcţia 5’→3’.

[5] Repetiţiile instabile sunt totdeauna modificate când sunt transmise de la părinţi la copii. Se produc şi expansiuni şi regresii (contracţii) dar, pentru motive neclare, predomină expansiunile.

[6] Imediat sub prag repetiţia este nepatogenă, imediat peste prag ea produce boală.

[7] Unii autori consideră că tractul poliglutaminic din produsul genei determină agregarea proteinei în anumite celule, pe care le omoară; alţii cred că regiunea poliglutaminică ar interfera activitatea enzimei glicolitice gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaza determinând  o reducere masivă a producţiei de energie din glucoză; stresul metabolic este sever în neuroni, care obţin energie numai din glucoză.

[8] Existenţa dezechilibrului de înlănţuire exclude posibilitatea ca expansiunile trinucleotidice să rezulte prin mecanisme de recombinare.

[9] In engleză se numesc splice site mutations.

[10] În engleză se numeşte exon skipping

[11] După alte evaluări, o persoană ce trăieşte într-o ţară dezvoltată primeşte circa 6-7 remi (1/3 din surse medicale) iar „doza de dublare” (valoarea de iradiere dincolo de care proporţia mutaţiilor se dublează) este de 30-80 remi per generaţie.

[12] Metilarea este un proces postreplicativ şi catena nou sintetizată nu este imediat metilată.

[13] Cea mai abundentă dintre ADN-glicozilaze este uracil ADN-glicozilaza (UNG) care produce îndepărtarea reziduurilor de uracil ce rezultă prin dezaminarea citozinei.

 

[14] Complexul BASC conţine proteinele BRCA1, ATM, complexul NBS1-MRE11-RAD50, proteinele MSH2/MSH6 şi MLH1 care intervin şi în calea MMR şi helicaza BLM .

[15] ISCN-(International System of Chromosomal Nomenclature) – Sistemul Internaţional de Nomenclatură a Cromosomilor

[16] Unii autori împart anomaliile de număr în poliploidii, aneuploidii şi mixoploidii (mozaicuri şi himere).

[17] Celulele normale sunt disomice pentru fiecare autosom şi cromosomul X la femeie.

[18] Efectul fenotipic al unui astfel de mozaic poate fi mai grav în condiţiile în care prin pierderea cromosomului suplimentar rezultă o disomie uniparentală, iar cromsomul resepctiv are loci amprentaţi genetic (vezi capitolul 5.C şi 5.D)

[19] Inversia pericentrică a cromosomului 9 – inv(9)(p11q12) – este considerată o variantă fenotipică normală.

 

[20] Prezenţa ambelor centromere rămase active determină anomalii de ataşare la fibrele fusului de diviziune şi dificultăţi de segregare în cursul diviziunii, ceea ce conduce la dispariţia frecventă a lor.

 

[21] S-a discutat şi reducerea competenţei „imunologice” dintre mamă şi făt odată cu creştere vârstei materne, fapt ca ar permite supravieţuira embrionilor trisomici; lipsesc probe pentru această ipoteză.

[22] Mecanismul afectării hepatice, diferit de afectarea pulmonară, implică agregarea şi stocarea proteinei Z în reticulul endoplasmic, datorită structurii sale modificate



 [A1]De adaugat o completare privind clusterul serpinelor si, la sfârşit agregarea hepatică precum si mutaţia ce determină alterarea coagulării; vezi Wilson, paginile 173-174

Back to Top