ELISA
Enzyme Linked Immunosorbent Assay
Antigenele sunt atasate la suportul solid. Excesul de antigen (moleculele care nu s-au legat) sunt indepartate prin spalare.
Se adauga anticorpul. Excesul de anticorp este indepartat prin spalare.
Se adauga un ligand care este capabil sa detecteze anticorpul. Acest ligand este legat covalent la o enzima (de ex. peroxidaza). Excesul de ligand este indepartat prin spalare.
Ligandul atasat la anticorp este vizualizat prin adaugarea unui cromogen – un substrat incolor care, care urmare a actiunii enzimei, este modificat intr-un compus colorat.
Testul se realizeaza in placi standard. Cantitatea de ligand este masurata prin determinarea cantitatii (densitatii optice) de produs colorat cu ajutorul unui spectrofotometru (ELISA reader).
Variante ale tehnicii ELISA:
Anticorpul primar este recunoscut de catre anticorpi secundari cuplati cu enzima.
Placa este cuplata cu anticorpi specifici pentru antigenul vizat. Se adauga antigenul, apoi un nou „strat” de anticorpi, cuplati cu enzima.
Antigenul este mai intai tratat in solutie cu anticorpi. Amestecul de antigene si anticorpi este ulterior adaugat peste o suprafata solida care prezinta antigen. Cu cat exista mai multe molecule de antigen in solutie, cu atat vor lega mai multe molecule de anticorp; astfel, vor ramane mai putine molecule de anticorp disponibile pentru legarea la antigenele de pe suprafata solida. Cu cat cantitatea de antigen din solutie este mai mare cu atat semnalul obtinut in placa va fi mai slab.
Tehnica poate fi utilizata de ex. pentru detectia de limfocite B care produc anticorpi sau limfocite T care produc citokine.
Limfocitele B sunt distribuite pe o suprafata tapetata cu antigen. Anticorpii secretati se vor lega in imediata vecinatate a celulelor B care i-au secretat. Spot-urile de anticorpi legati vor fi detectate prin utilizarea unui anticorp secundar cuplat la un sistem enzimatic.
Pentru detectia limfocitelor T secretante de citokine, placile sunt tapetate cu anticorpi anti-citokine. Citokinele secretate se vor lega in proximitatea celulelor care le-au produs. Detectia se va face cu ajutorul unui alt anticorp anti-citokina, cuplat la un sistem enzimatic.
