Tratat genetica: capitolul 2

STRUCTURA  ŞI  ORGANIZAREA  CELULARĂ  A  ADN

 

ADN este molecula fundamentală a vieţii. Toate mecanismele prin care se realizează structura şi funcţiile celulelor, asamblate în ţesuturi şi organe, precum şi răspunsurile lor la acţiunea mediului intern sau extern – sunt codificate şi reglate de structura uimitor de simplă şi elegantă a genomului uman. De aceea, înţelegerea structurii ADN şi a organizării sale în celule este fundamentală pentru studiul geneticii medicale şi medicinei în general. 

 

A.   ADN  ESTE  SUBSTRATUL  MOLECULAR  AL  EREDITĂŢII

 

  1.  EVOLUŢIA  CONCEPŢIILOR  DESPRE  NATURA  GENEI.

 

            În anul 1865, MENDEL a formulat ipoteza genei potrivit căreia fiecare caracter este detreminat de “o pereche de factori ereditari” (numiţi mai târziu gene)  şi a stabilit legile eredităţii. Astfel, el a pus bazele geneticii ca ştiinţă.

            Iniţial, în ipoteza lui Mendel, gena era o entitate abstractă, ipotetică,  şi natura sa chimică era necunoscută. Ulterior, la începutul secolului XX,  demonstrându-se rolul cromosomilor în ereditate (Sutton, Boveri şi mai ales T.H.MORGAN), gena a devenit un element concret, material, un segment dintr-un cromosom care determină un caracter specific, dar natura ei chimică a rămas în continuare necunoscută.

            La începutul deceniului patru s-a stabilit că în structura cromosomilor există proteine şi acizi nucleici: ADN şi ARN; una din aceste componente trebuia să fie substratul chimic al genei.  Mulţi cercetători credeau atunci că genele sunt formate din proteine, cele mai complexe substanţe chimice din celule; ADN era considerat o moleculă prea simplă pentru înmagazinarea informaţiei ereditare şi transmiterea ei în succesiunea generaţiilor. Existau totuşi unele argumente "indirecte" care pledau pentru rolul genetic al ADN: localizarea aproape exclusivă a ADN în nucleu şi cromosomi, structuri cu rol important în ereditate; cantitatea sa constantă şi caracteristică speciei, proporţională  cu numărul cromosomilor  (celulele sexuale au jumătate din ADN-ul celulelor somatice); stabilitatea  metabolică a moleculei de ADN. În 1944, Avery et al. au demonstrat experimental că ADN-ul este substratul molecular al eredităţii.

 

2. DEMONSTRAREA  ROLULUI  GENETIC  AL  ADN.

 

            În 1928, microbiologul englez  F. Griffith a făcut o observaţie remarcabilă. El a studiat morfologia şi patogenitatea diferitelor tulpini de pneumococus. Unele tulpini aveau o capsulă polizaharidică şi cultivate pe agar formau colonii "netede", fiind numite S (de la "smooth") iar altele erau necapsulate şi formau colonii "rugoase", fiind numite R (de la "rough"). Griffith  a observat că şoarecii injectaţi cu pneumococi S au murit iar cei injectaţi cu tulpina R au supravieţuit; deci pneumococii S erau patogeni, producând septicemie şi moarte. Patogenitatea, deteminată de prezenţa capsulei, se transmite ereditar. În mod surprinzător, un amestec de pneumococi R (nepatogeni) vii  şi pneumococi S (patogeni) inactivaţi prin căldură a avut un efect letal. De la animalele moarte s-au izolat pneumococi S vii. Explicaţia posibilă a acestui fenomen era transformarea tulpinilor de pneumococi R vii în tulpini S vii, sub influenţa unor componente din structura pneumococilor S omorâţi; natura chimică a substanţei care a produs transformarea nu a putut fi însă stabilită.

            În 1944, Avery, Mac Leod, Mc Carty (de la Rockefeller Institut) au reluat experienţele lui Griffith şi au demonstrat experimental că ADN-ul este factorul transformant. Autorii au arătat că transferul ADN extras de la o tulpină de pneumococi S capsulaţi, patogeni, la pneumococi R necapsulaţi, nepatogeni, determină transformarea lor în pneumococi patogeni (R -> S); mai exact, un segment de ADN-S ce conţine gena pentru capsulă a fost încorporat în ADN-ul pneumococilor R. Această modificare nu era realizată de proteine  sau  de alte  componente  din  structura  pneumococilor  S  şi era  inhibată de ADN-ază (figura 2.1); odată produsă, modificarea  se transmite la generaţiile următoare, fiind deci ereditară. Pe această bază s-a presupus că  ADN este materialul genetic.

            Aşa cum se întâmplă adesea cu marile adevăruri, rolul genetic al ADN, clar şi elegant demonstrat de Avery et al. a fost însă un timp negat. În 1952, Hershey şi Chase (Premiul Nobel, 1969) au demonstrat că transferul exclusiv al ADN de la bacteriofagi la Escherichia coli transformă această bacterie în celule producătoare de particule fagice, cu o structură completă, inclusiv capsula proteică (figura 2.2). Autorii au marcat proteinele capsulare ale bacteriofagilor cu sulf radioactiv (³²S) iar ADN cu fosfor radioactiv (³⁵P); când bacteria E. coli a fost infectată cu bacteriofagi "marcaţi", se observă că numai  ³⁵P  (deci  ADN) pătrunde în celulă (³²S – proteinele capsulare rămân la exterior). Formarea ulterioară a unor particule fagice noi, complete, demonstrează clar că ADN era unicul purtător al informaţiei ereditare.

            Demonstrarea faptului că transferul ADN de la un microorganism la altul produce transformări permanente şi ereditare ale primitorului a constituit dovada decisivă că genele sunt alcătuite din ADN.

            Experienţele de transformare ereditară produse de ADN şi numeroase alte dovezi au stat la baza unei noi paradigme fundamentale în biologie şi au inaugurat revoluţia moleculară în genetică. Introducerea unor segmente de ADN în celule cultivate "in vitro" (transfecţie) sau în zigoţi / embrioni ("animale transgenice") stă la baza ingineriei genetice. Mai mult, ea reprezintă principiul de bază al terapiei genice, cea mai extraordinară realizare a medicinei ultimilor ani.

 

B.  STRUCTURA   ADN

 

            Descoperirea rolului genetic al ADN[1] a concentrat atenţia cercetătorilor asupra structurii sale, întrucât descifrarea ei reprezenta singura cale pentru înţelegerea naturii şi funcţiei genei. În anul 1953, James Watson şi Francis Crick au propus un model al moleculei de ADN alcătuit din două catene polinucleotidice, legate complementar prin bazele azotate, înfăşurate într-o elice dublă, răsucită spre dreapta.

            Modelul WATSON-CRICK al structurii ADN reprezintă, probabil, cea mai mare descoperire a biologiei moderne (Premiul NOBEL, 1962). Acest model, universal valabil în lumea vie, corespunde funcţiilor materialului genetic, deoarece explică modul în care se stochează, se transmite şi se exprimă informaţia ereditară. Gena încetează să mai fie o entitate "misterioasă", are o structură chimică complexă şi bine definită, iar ADN devine nu numai esenţa geneticii ci şi un veritabil simbol al vieţii. Consecinţele pentru practica medicală ale revoluţiei determinate de către descoperirea structurii şi funcţiei ADN sunt şi vor fi atât de spectaculoase încât nu vor avea egal în istoria medicinii.

 

1.  STRUCTURA  PRIMARĂ  ŞI   SECUNDARĂ  A   ADN.

 

STRUCTURA PRIMARĂ A  ADN.

            ADN este un macropolimer de "deoxiribonucleotide". Lungimea şi greutatea sa moleculară sunt foarte mari, permiţând stocarea unei cantităţi uriaşe de informaţie. Cantitatea de ADN variază de la specie la specie (la om g.m.=3,5 x10¹² daltoni) dar este constantă la indivizii aceleiaşi specii, precum şi în toate celulele somatice (diploide) de la acelaşi individ.

            Unitatea structurală a ADN este deoxiribonucleotidul, alcătuit din trei elemente distincte: un glucid cu cinci atomi de carbon (o pentoză), o bază azotată şi un grup fosfat – unite prin legături covalente (puternice) (figura 2.3). Pentoza este reprezentată de D-2-deoxiriboza, în forma sa furanozică. Baza azotată poate fi purinică – adenina (A), guanina (G) – sau pirimidinică – timina (T), citozina (C); se leagă la C1’ al deoxiribozei, alcătuind împreună un nucleozid. Grupul fosfat (provenit din acidul ortofosforic) se leagă la C5’ al deoxiribozei, formând cu aceasta şi baza azotată un nucleotid, unitatea fundamentală a structurii catenei de ADN. Grupul fosfat conferă moleculei de ADN caracterul de "acid" şi numeroase sarcini negative, neutralizate in vivo prin fixarea histonelor, proteine bazice. În ADN, există patru tipuri de deoxiribonucleotide – acid deoxiadenilic, deoxiguanilic, deoxicitidilic, deoxitimidilic – care se vor deosebi numai prin baza azotată; gruparea fosfat şi deoxiriboza sunt elemente constante.

            Polimerizarea nucleotidelor, în molecula de ADN, se realizează prin legături covalente 3'- 5' fosfodiester, formate între gruparea OH a C₃ al deoxiribozei unui nucleotid şi restul fosfat fixat la C₅ al nucleotidului următor. Se formează astfel o catenă (lanţ) continuă, lineară (neramificată!), care reprezintă structura primară a ADN. Această catenă prezintă o parte "constantă", fosfoglucidică (în care gruparea fosfat alternează regulat cu deoxiriboza), ce formează axul catenei, şi o parte "variabilă", reprezentată de bazele azotate, care se fixează perpendicular şi lateral pe "coloana vertebrală" fosfoglucidică (bazele azotate de pe aceeaşi catenă nu se leagă între ele) (figura 2.4).

            În catena de ADN poziţia unui nucleotid nu impune cu necesitate în vecinătatea sa prezenţa unui anumit alt nucleotid: poziţiile adiacente pot fi ocupate de oricare din cele patru tipuri de nucleotide. Deci, nu există nici o restricţie în dispunerea / succesiunea nucleotidelor în lungul catenei de ADN sau, altfel spus, există o libertate totală de aşezare a nucleotidelor. Acest lucru este esenţial deoarece secvenţa (ordinea) nucleotidelor în lungul catenei de ADN reprezintă informaţia genetică codificată, pe baza căreia se stabileşte ordinea aminoacizilor în proteine. Sensul de "citire" al informaţiei genetice este determinat de polaritatea 5' -> 3' a catenei de ADN . Ea este dată de faptul că poziţiile 5'-fosfat a primului nucleotid şi 3'-hidroxil a ultimului nucleotid al catenei sunt libere, neangajate într-o legătură chimică. Orice secvenţă de nucleotide se "citeşte" în direcţia 5' -> 3' şi se scrie cu capătul 5' la stânga, de ex. 5'-ATGCCTAGATCA-3'. Fiecare catenă a ADN este deci o secvenţă orientată, definită prin înlănţuirea nucleotidelor. 

 

1.2. STRUCTURA SECUNDARĂ   A   ADN.

            În elaborarea modelului structurii ADN-ului, WATSON şi CRICK s-au bazat pe studiile difracţiei cu raze X a moleculelor de ADN (M. Wilkins, R. Franklin) precum şi pe analizele chimice ale ADN (Chargraaf).

Imaginile obţinute prin difracţie cu raze X a unor molecule de ADN de origini diferite erau totdeauna asemănătoare, relevând, deci, un "model unic" şi sugerând că moleculele de ADN au o organizare bine definită, ordonată, în care părţile componente se repetă ele însele. Modelul sugerează existenţa mai multor catene polinucleotidice şi o structură helicală ordonată. Analizele chimice ale ADN au evidenţiat că suma bazelor purinice (A+G) este însă întotdeauna egală cu suma bazelor pirimidinice (T+C) iar raportul A/T şi G/C este unitar, indiferent de specie; în schimb raportul A+T/G+C este diferit de 1 şi caracteristic speciei fiecărei specii; la om este 1,7.

            Prelucrând creator aceste date, Watson şi Crick au propus un model al moleculei de ADN alcătuit din două catene polinucleotidice, legate între ele prin bazele azotate, în mod complementar (figura 2.5 A) şi înfăşurate plectonemic pentru a forma o dublă spirală elicoidală (o elice dublă) orientată spre dreapta, cu diametrul de 20 Å şi pasul elicei de 34 Å (figura 2.5.B). Pornind de la faptul că raportul  A/T = G/C = 1, Watson şi Crick consideră că în molecula de ADN se produce o împerechere "preferenţială" a bazelor care unesc cele două catene; bazele azotate (situate spre interiorul moleculei) se leagă complementar: o bază purinică se uneşte cu o bază pirimidinică sau, mai exact  A − T şi G − C (formând un cuplu sau o pereche de baze, prescurtat pb). Legăturile se realizează prin punţi de hidrogen, legături electrostatice slabe (figura 2.5 A). În felul acesta secvenţa nucleotidelor unei catene determină cu necesitate secvenţa nucleotidelor celeilalte catene. Deci, cele două catene ale ADN nu sunt identice, ci complementare şi strict codeterminate. Cunoaşterea secvenţei nucleotidice a unei catene va permite automat determinarea secvenţei nucleotidice a celeilalte catene. De exemplu:    

                                                5'-ATGCCAG-3'

                                                3'-TACGGTC-5'.

            În acest context vom sublinia o idee asupra căreia vom reveni: legea complementarităţii bazelor stă la baza mecanismelor prin care se realizează funcţiile genetice ale ADN: transcripţia, replicarea, repararea leziunilor, recombinarea.

Libertatea totală de aşezare a nucleotidelor în lungul catenelor de ADN ( pe verticală) se asociază cu necesitatea dispoziţiei lor complementare (în planul orizontal al moleculei). "Libertatea şi necesitatea" dau substratul eredităţii înalta sa diferenţiere şi capacitate de a stoca, exprima şi transmite perfect mesajul pe care îl deţine" (Parot, 1985). În molecula simbol a vieţii este astfel "înscris" unul din principiile filosofice fundamentale ale existenţei omului: libertate şi necesitate.

            Legăturile stereochimice / spaţiale necesare pentru împerecherea corectă dintre A−T şi G−C fac ca orientarea (polaritatea) celor două catene să se dirijeze în sensuri opuse, deci, să fie antiparalele. Acest lucru are consecinţe importante în "citirea" informaţiei în procesul sintezei proteice, precum şi în mecanismul replicării (biosintezei unor noi molecule de ADN).

            Cele două catene ale ADN se înfăşoară (se împletesc) plectonemic (una în jurul alteia, ca "o frânghie", şi amândouă în jurul unui ax central (imaginar) al moleculei, formând o dublă spirală elicoidală coaxială (o elice dublă), orientată spre dreapta (dextrogir) (figura 2.5 B). Ea poate fi comparată cu o "scară în spirală" în care axele fosfoglucidice formează marginile scării iar perechile de baze, treptele ei. Această structură, asociată funcţiilor majore pe care le îndeplineşte ADN, a fost plastic numită "elicea vieţii", fiind un  veritabil simbol al lumii vii.

            Structura ADN este, în ansamblul ei, perfect regulată, ordonată: diametrul moleculei 2 nm; o tură completă are 360⁰; pasul elicei 3,4 nm permite dispunerea a 10 perechi de baze (figura 2.5. b). În configuraţia ei spaţială, molecula de ADN prezintă două şanţuri  laterale: unul mai mic şi altul mai mare. Ele sunt importante în recunoaşterea stereochimică şi fixarea pe ADN a histonelor (la nivelul şanţului mici) sau a unor molecule proteice reglatoare (la nivelul şanţului mare), singurul loc în care bazele sunt accesibile acestor proteine care vor influenţa (regla) realizarea funcţiilor ADN.

            În condiţii fiziologice, molecula de ADN are o mare stabilitate metabolică, datorită legăturilor fizico-chimice dintre elementele unei catene precum şi dintre cele două catene [2]. Ele sunt strâns legate una de alta şi de obicei nu se pot separa. Această stabilitate este o condiţie obligatorie pe care trebuie să o îndeplinească substratul material al eredităţii. Totuşi, sub acţiunea unor enzime cele două catene ale ADN se pot desface parţial, pe segmente limitate, şi funcţionează ca "matriţă" pentru sinteza unor molecule noi, complementare (ARNm în procesul de transcripţie, sau o altă catenă ADN, în cursul replicării).

 

 

Caseta   2.1.

Denaturarea  şi  hibridizarea  ADN.

 

În condiţii experimentale se poate produce ruperea (desfacerea) legăturilor de hidrogen dintre cele două catene, prin denaturare termică (încălzire la 63-100°C) sau chimică (tratament cu alcali etc.) (figura 2.6). Acest proces de conversie a ADN de la forma bicatenară la starea monocatenară se numeşte denaturare. Prin răcirea lentă a soluţiei, monocatenele de ADN se pot reasocia pe baza complementarităţii şi refac structura originală; procesul se numeşte renaturare sau hibridare. Viteza de reasociere este funcţie de concentraţia ADN şi timp (se numeşte cot  de la concentraţie x timp; valoarea cot la care se produce o asociere de 50% se numeşte cot 1/2). Prin răcire bruscă monocatenele ADN rămân separate şi pot fi folosite pentru realizarea unor hibrizi moleculari (pe baza complementarităţii dintre catene ) de tip ADN-ADN, fie între două molecule de ADN de la specii diferite fie între fragmente de ADN obţinute artificial ("sonde", ce corespund unei gene) şi regiunea corespunzătoare, complementară din ADN nativ. Se pot obţine de asemeni hibrizi între o catenă ADN şi o moleculă de ARN complementară (de tip ARNm) rezultând un heteroduplex. Fenomenele de denaturare şi hibridare sunt amplu utilizate în biologia moleculară, în tehnicile ADN recombinant, pentru identificarea sau localizarea unor gene şi, mai recent, în terapia cu oligonucleotide antisens (în cancere, SIDA) care se fixeză pe secvenţe de ADN sau pe ARNm  şi  blochează expresia genelor.  

 

 

 RELAŢIILE  DINTRE  STRUCTURA  ŞI  FUNCŢIILE   ADN

            Modelul structurii ADN întruneşte toate condiţiile pe care trebuie să le îndeplinească materialul genetic:

să stocheze o cantitate mare de informaţie, într-o formă stabilă, dar uşor de exprimat;

să reproducă  informaţia,  deci  să o transmită  cu mare fidelitate de la o generaţie la alta, eventual să  o  "repare" corect, dacă se produce o leziune;

să exprime informaţia genetică prin sinteza unor proteine specifice;

să fie capabil de variaţie.

Aceste proprietăţi fundamentale şi caracteristice ale ADN îi conferă calitatea de a fi molecula esenţială a vieţii.

            a. Informaţia genetică

            ADN deţine, prin genele pe care le posedă, informaţiile necesare pentru ca celulele să trăiască, să se multiplice şi să se diferenţieze (căpătând anumite specializări). În ansamblul organismului, ADN determină şi controlează embriogeneza, dezvoltarea, creşterea, metabolismul şi reproducerea – deci toate procesele majore ale funcţionării organismului uman.

            Informaţia genetică necesară acestor procese este reprezentată de secvenţa lineară  (succesiunea sau ordinea de înlănţuire) nucleotidelor în molecula de ADN; ea determină structura proteinelor care alcătuiesc celulele şi ţesuturile şi participă la funcţionarea lor complexă. Proteinele sunt formate din lanţuri de aminoacizi; secvenţa aminoacizilor  în proteină determină proprietăţile caracteristice ale fiecărei proteine; această ordine specifică a aminoacizilor este determinată de secvenţa nuclotidelor în ADN.

            Informaţia ereditară este codificată, fiind scrisă într-un limbaj foarte simplu, cu ajutorul unui "alfabet nucleic" ce are numai patru "litere": A, T, G şi C (corespunzătoare celor patru tipuri de nucleotide). Folosind aceste elemente de cod se pot scrie "cuvinte" de trei litere, asamblate într-o "frază" ce alcătuieşte o genă. La fiecare triplet de nucleotide, numit codon corespunde pe baza codului genetic (vezi capitolul 4), un anumit aminoacid din structura proteinei sau un "semnal" necesar pentru a începe sau termina lectura mesajului (figura 2.7).

            Gena este unitatea de informaţie ereditară; ea este alcătuită dintr-o succesiune specifică de codoni, ce determină ordinea aminoacizilor într-un polipeptid şi, prin aceasta, funcţia lui. Modificarea secvenţei nucleotidelor prin mutaţia genei va duce la modificarea unui / unor codon(i) şi, de cele mai multe ori, la modificarea structurii şi funcţiei proteinei sintetizate .

             b.  Expresia informaţiei ereditare

            Expresia informaţiei ereditare reprezintă, în esenţă, sinteza de proteine.  

            Informaţia genetică codificată din ADN nu este folosită direct în sinteza proteinelor (figura 1.1 şi 2.7). Ea este mai întâi copiată – transcripţie – într-o moleculă de ARNm, folosind acelaşi cod şi mecanismul complementarităţii. Urmează apoi translaţia sau decodificarea informaţiei genetice din ARNm într-o secvenţă specifică de aminoacizi a proteinei, pe baza corespondenţei dintre fiecare codon şi un anumit aminoacid.

            Copierea informaţiei în ARNm se face numai de pe una din catenele ADN, catena 3'->5', numită catenă copiată sau matriţă[3]. Ea este totdeauna aceeaşi pentru o anumită genă dar la gene diferite poate fi una sau alta din catenele ADN. Catena ADN complementară catenei transcrise este similară cu ARNm ca secvenţă (exceptând înlocuirea timinei cu uracilul) şi direcţie (5' -> 3') şi se numeşte catenă de referinţă ("sens"). După desfacerea enzimatică, temporară, a legăturilor de hidrogen dintre cele doua catene ale ADN, copierea se face în direcţia 3' -> 5', sintetizându-se o moleculă complementară şi antiparalelă (5' -> 3') de ARNm; ea va avea aceeaşi secvenţă şi orientare ca şi catena de referinţă. De aceea, notarea şi descrierea unei gene se fac, convenţional, referindu-se la catena 5' -> 3' de referinţăa ADN.

Mult timp s-a considerat că transferul de informaţie se face într-o singură direcţie: ADN->ARNm->Proteină. Această "dogmă fundamentală a geneticii" a fost reevaluată prin identificarea "transcripţiei inverse", de la ARNm -> ADN. Prin acest mecanism retrovirusurile, care au ca material genetic ARN, se pot încorpora în genomul celulei-gazdă, confecţionându-şi o copie complementară de "tip ADN". Fenomenul este larg folosit astăzi şi în "ingineria genetică" (vezi capitolul 3.C.3) pentru obţinerea unor molecule de ADN complementar faţă de ARNm extras din celule; în fond acest ADNc reprezintă gena (mai exact partea codantă) pe baza căreia se va sintetiza ARNm şi apoi proteina corespunzătoare.

            c. Replicarea şi repararea ADN

            O proprietate esenţială a ADN este capacitatea de a servi ca model (matriţă) pentru autoreplicarea sa şi sinteza unor noi molecule, identice informaţional între ele şi cu molecula iniţială. Pentru aceasta, cele două catene ale ADN se desfac şi fiecare serveşte ca matriţă pentru aranjarea secvenţială şi complementară a deoxiribonucleotidelor. Prin polimerizare lor se formează o catenă "nouă" care reface împreună cu catena "veche" o moleculă de ADN (vezi  figura 1.1). Replicarea semiconservativă a ADN este cheia eredităţii: un organism parental transmite prin gameţi o replică a ADN-ului său primei celule a descendenţilor. Astfel, prin replicare, informaţia ereditară se perpetuează în mod stabil în cursul generaţiilor.

            Uneori în cursul replicării se pot produce erori, prin împerecheri "nelegitime" (greşite) ale nucleotidelor (de tipul C-C, A-G sau A-C). Ele ar putea produce o modificare a informaţiei genetice dacă nu ar interveni un mecanism enzimatic  de "reparare"; pe baza catenei matriţă, aceasta corijează erorile de replicare (vezi capitolul 5.A.1)

 

2. POLIMORFISMUL  STRUCTURAL

 ŞI   FLEXIBILITATEA  MOLECULEI   DE   ADN

 

            Forma clasică a structurii ADN, descrisă de Watson şi Crick, corespunde conformaţiei de tip B, care se realizează frecvent "in vivo" (în condiţii de umiditate crescută şi concentraţie ionică joasă). S-au descris însă şi alte conformaţii sau isoforme: A şi C, mai frecvente, D şi E, mai rare. Ele au acelaşi plan general de structură: elice dublă orientată spre dreapta dar se deosebesc de tipul B printr-o serie de particularităţi fizice (înclinarea bazelor faţă de ax, modificarea pasului elicei şi numărul de baze per tură elice): forma A este mai scurtă şi mai groasă, iar celelalte mai lungi şi mai subţiri.

            În organism, în anumite regiuni ale moleculei de ADN (cu o anumită secvenţă nucleotidică) se produc  frecvent modificări (tranziţii) conformaţionale A « B «C. Aceste modificări permit recunoaşterea segmentelor respective de către anumite molecule exogene, care reglează expresia genelor.

            În 1979, Rich şi Dickerson descoperă un tip particular de ADN-Z sau ADN-senestra. El are o moleculă dublu elicală, orientată spre stânga, care îşi pierde simetria caracteristică formei B, deoarece axul fosfo-glucidic ia o formă neregulată în zig-zag, producând deformarea şi alungirea moleculei de ADN (figura 2.8).  Conformaţia ADN-Z este o conformaţie normală, există "in vivo" şi apare, în anumite condiţii fizico-chimice, în regiunile bogate în perechi de baze G-C, prin tranziţia / conversia formei B (sub acţiunea unei topoisomeraze, prin rotarea bazelor cu 180° ); tranziţia B « Z este reversibilă.

            ADN-Z intervine foarte probabil în inactivarea unor gene şi, deci, în controlul expresiei informaţiei genetice. Conversia locală B -> Z (mai ales în situsurile de reglare a transcripţiei) poate fi realizată prin fixarea mai intensă a histonelor  sau a altor molecule ce produc represia genelor sau  prin metilarea citozinei din situsurile GC. Astfel, un "viraj la stânga" la începutul unei gene determină stoparea activităţii ei.

            Tranziţia B « Z ar determina însă şi evidenţierea unor situsuri din ADN în care se fixează mai facil agenţi mutageni sau cancerigeni. Pentru aceasta pledează faptul că mutaţiile apar mai frecvent la nivelul secvenţelor G-C care iau conformaţia Z.

            În finalul acestei prezentări este important de subliniat faptul că tranziţia ADN B«Z ca şi modificările conformaţionale A « B « C care apar în anumite regiuni ale ADN (cu o secvenţă specială a nucleotidelor), demonstrează elocvent faptul că molecula de ADN nu are o structură fixă, rigidă, încremenită. În funcţie de condiţiile de mediu, moleculele ADN sînt flexibile, într-o permanentă stare dinamică, deformându-se neîncetat; pe drept cuvânt se poate spune că molecula de ADN (simbolul vieţii) "pulsează sau respiră".

 

C.   STRUCTURA   GENOMULUI  UMAN

 

Termenul de genom a fost creat (Winkler, 1920) pentru a denumi setul haploid de cromosomi din gameţii eucariotelor. Ulterior el a fost folosit pentru a desemna ansamblul genelor unui organism dar descoperirea ADN necodant, diferitelor clase de ADN repetitiv şi altor elemente de „anatomie”, au dus la semnificaţia actuală a genomului, conceput ca ansamblul complex al secvenţelor de ADN a unui individ sau specii.

            Cunoştinţele despre genomul uman au fost dependente în timp de metodele folosite. Descoperirea tehnologiei ADN recombinant a marcat începutul unei perioade revoluţionare pentru biologie în general şi medicină în special. În 1980 a apărut ideea Proiectului  Genom  Uman, care treptat a început să prindă contur, devenind în 1990 un important proiect internaţional destinat să stabilească harta fizică şi genetică a genomului uman şi, în final, să determine întreaga secvenţă a ADN uman dar şi altor organisme (veyi capitolul 3.D.4). Coordonarea cercetărilor a fost realizată de Human Genome Organization (HUGO), care după descoperirea hărţii genetice a omului (1995) a propus descifrarea întregii secvenţe a genomului uman. Proiectul demarează însă abia în 1999 şi doi ani mai tîrziu, la 15 februarie 2001, International Human Genome Sequencing Consortium (IHGSC) precum şi compania privată Celera Genomics au publicat prima schiţă (ciornă) a secvenţei genomului uman, ce acoperă 96% din partea eucromatică (activă) a genomului uman; heterocromatina este greu de clonat datorită structurii sale repetitive şi se consideră că nu are sau are doar câteva gene. Deşi mai sunt multe de făcut până la finalizarea completă (în 2003) a proiectului (stabilirea unei secvenţe continue, unice, pentru cei 24 de cromosomi umani şi a poziţiei precise a tuturor genelor) iar unele detalii se vor schimba,  există multe puncte clare. De aceea, în prezentarea organizării genomului uman, vom ţine cont în special de aceste elemente certe.

 

Date generale.

 

Cantitatea totală de ADN din celulele umane diploide a fost apreciată la 7 picograme sau 3,5 picograme per genom haploid, ceea ce corespunde teoretic la circa 3,3 miliarde de perechi de baze (pb). Mărimea genomului haploid este constantă la fiecare specie şi se mai numeşte valoare C; ea prezintă evident variaţii în cursul ciclului celular: 2C la sfârşitul diviziunii şi faza G1, 4C după replicarea ADN în faza S şi în G2.

            Mărimea totală estimată a genomului uman, apreciată de IHGSC în 2001, este de 3,2 Gb (gigabaze = miliarde de baze); din acestea 2,95 Gb reprezintă eucromatina, segmentul „funcţional” al genomului, iar restul heterocromatina inactivă. Surprinzător este că secvenţele codante reprezintă mai puţin de 5% din genom (numai 1,1% -1,4% sunt secvenţe ce codifică proteine) iar numărul prognozat de gene este cuprins între 30.000 şi 35.000, jumătate faţă de  estimările anterioare (din acestea numai 26.000 au fost identificate, deşi la multe încă nu se cunoaşte cu precizie rolul, efectul lor). Deci genele, ce conţin ADN "codant", sunt pur şi simplu nişte "insule" într-un "ocean" de ADN necodant; acestă dispoziţie este nu numai surprinzătoare (prin logica "economiei" sau "rentabilităţii") dar şi misterioasă. Cert este că genomul nu poate fi considerat o succesiune de gene pe cromosomi ci o structură cu arhitectură complexă în care genele (fragmentate) sunt dispersate pe cromosomi şi separate prin largi regiuni intergenice, necodante. Acest ADN necodant (numit uneori şi "egoist", deoarece nu participă la  formarea de proteine) nu este probabil în totalitate "inutil": evidenţierea unor secvenţe perfect organizate, din care unele sunt chiar transcrise, sugerează că cel puţin o parte din acest ADN ar putea juca un rol, pentru moment necunoscut.

Genomul uman este alcătuit dintr-un genom nuclear complex, ce conţine marea majoritate a ADN-ului celular (3,2 Gb) şi un genom mitocondrial simplu şi mic (16,6 Kb).

 

2. GENOMUL  NUCLEAR

 

2.1. Fragmentarea  genomului  uman.

Nucleul celulelor umane conţine peste 99 % din ADN celular. Această cantitate enormă de ADN este fragmentată în 24 de tipuri distincte de molecule lineare de ADN care, prin asociere cu proteine histonice şi nehistonice, formează cromosomii: 22 de tipuri distincte de autosomi şi doi cromosomi sexuali, X şi Y. Mărimea lor variază de la 244 Mb pentru cromosomul 1 la 44 Mb pentru cromosomul 21 iar structura lor este neuniformă, prin compoziţie nucleotodică şi densitate de gene, producând un model caracteristic de benzi, colorate şi necolorate, pentru fiecare cromosom.

 

            2.2. Heterogenitatea  secvenţelor  nucleotidice  a   ADN.

            In genomul uman există mai multe "clase" de ADN, diferite prin repetiţia secvenţelor nucleotidice: ADN nerepetitiv, ADN moderat repetitiv şi ADN înalt repetitiv.

ADN nerepetitiv

            ADN nerepetitiv (60%) este alcătuit din secvenţe unice per genom sau în număr foarte mic de exemplare (formând familii multigenice); se găseşte  mai frecvent în regiunile cromosomice active transcripţional, mai puţin condensate, cunoscute sub numele de eucromatină.  Doar o mică parte (2%) din ADN nerepetitiv alcătuieşte regiunile codante ale genelor ce codifică proteine (exonii). Ele sunt transcrise de ARN polimeraza II şi, de aceea, se numesc "gene de clasă II". Restul ADN-ului nerepetitiv este necodant şi are funcţii încă necunoscute; se găseşte în interiorul genei (introni) şi în regiunile ce separă genele.

b. ADN moderat repetitiv

            ADN moderat repetitiv (30 %) este alcătuit din secvenţe scurte, de 300-1000 pb (rar mai mari), repetate de zeci şi sute de mii de ori şi dispersate în genom; majoritatea secvenţelor moderat repetitive sunt transcrise în ARN şi formează frecvent "familii" de secvenţe înrudite, unele cu funcţie cunoscută (codante pentru ARNr şi ARNt), altele cu funcţie necunoscută (secvenţele SINEs sau LINEs).

Genele ribosomale, pentru ARNr[4], sunt transcrise de ARN polimeraza I (şi numite "gene de clasă I"). Ele se găsesc în unităţi repetate în tandem ce formează 150-200 copii, localizate pe braţele scurte ale cromosomilor acrocentrici, în regiunile "organizatorilor nucleolari", care formează nucleolii în nucleul interfazic; excepţie fac genele pentru ARNr 5S situate pe cromosomul 1q42, aproape de telomer.

Genele pentru ARNt (şi alte molecule mici de ARN), transcrise de ARN polimareza III ("gene de clasă III") sunt organizate în grupe de gene repetate în tandem şi localizate în diferiţi cromosomi (mai ales 1 şi 6).

Secvenţele SINEs ("short interspersed repeated sequences") sunt secvenţe scurte de 100-400 p.b., existente în circa 500.000 de copii (3-5% din genom), dispersate în cromosomi;ele sunt reprezentate în special de familia Alu[5]. Funcţia lor nu este cunoscută; s-a presupus că ar avea un rol în iniţierea replicării în diferite puncte ale ADN. Secvenţele Alu pot acţiona ca elemente transpozabile.

Secvenţele LINEs ("long interspersed repeated sequences") au lungimea de 6-7 kb, se află în circa 100.000 copii, dispersate în genom; se cunosc familia L1 (sau Kpn 1) şi The 1. Ca şi secvenţele Alu par să multiplice prin retrotranspoziţie. Secvenţele LINEs au foarte probabil rol în împerecherea corectă a cromosomilor omologi în meioză, condiţie esenţială pentru schimbul egal de segmente cromosomice. Se consideră că prin împerechere incorectă între secvenţe identice dar din poziţii şi uneori cromosomi diferiţi se pot produce (prin CO inegal) recombinări aberante care generează mutaţii şi deci boli genetice.

            c. ADN înalt repetitiv

            ADN înalt repetitiv (10 % din genom) este alcătuit din secvenţe foarte scurte (2-200 p.b.), repetate în tandem (->->->->), de milioane de ori; ele nu sunt transcrise. Unele secvenţe de ADN înalt repetitiv, numite si ADN satelit (a, b, 1, 2, 3) alcătuiesc blocuri mari de heterocromatină constitutivă în anumite regiuni cromosomice: centromer, telomere, constricţii secundare, benzile G, etc; ele au evident un rol structural[6]. Alte secvenţe foarte scurte (14-65 p.b.) şi repetate în tandem sunt dispersate în toţi cromosomii (excepţie X şi Y), ocupând anumite situsuri precise; aceste secvenţe formează minisateliţii hipervariabili (sau VNTR de la "variable number of tandem repeats"). Mai există secvenţe de 1-13 p.b., formate de regulă din repetiţia unui dinucleotid (în special AC Şi AT), cu o structură foarte polimorfă şi cu o distribuţie uniformă în genom; ele se numesc microsateliţi (STR sau VNDR).

Minisateliţii  sunt alcătuiţi dintr-o regiune centrală, cu o secvenţă identică (ce poate fi pusă în evidenţă cu o sondă specifică)  şi regiuni periferice variabilă. Ei sunt nişte veritabili markeri genetici individuali: numărul de repetiţii al secvenţei unui minisatelit variază de la o persoană la alta. Numărul mare de minisateliţi şi de variante pentru fiecare din ei fac ca probabilitatea întâlnirii a doi indivizi identici (dar neînrudiţi) cu acelaşi profil să fie mai mică de 10^-20. Minisateliţii reprezintă "amprenta genetică" a fiecărui individ (figura 2.11) folosită astăzi în: medicina legală, cartografierea genomului uman, diagnosticul molecular al bolilor genetice, analiza cromosomică.

Mai recent, IHGSC (2001) stabileşte că secvenţele repetitive  alcătuiesc mai mult de 55% din schiţa genomului uman şi le împarte în cinci clase: (1) repetitii dispersate, produse de transposoni; (2) copii inactive a genelor sau pseudogene; (3) repetitii de secvenţe simple (SSRs); (4) duplicaţii segmentare a unor blocuri de 10-300kb; (5) blocuri repetate în tandem, localizate la centromer, telomere, braţe scurte cromosomi acrocentrici.

Cele mai multe secvenţe repetitive (circa 45%) sunt derivate prin transpoziţie. La mamifere şi om, elementele transposabile sunt de patru feluri: LINEs, SINEs, retrotransposoni LTR (elemente asemănătoare retrovirusurilor) şi transposoni ADN „fosili” (asemănători cu Tn bacterieni). Primele trei categorii transpozează prin intermediul unei copii de ARN, care sub acţiunea unei transcriptaze inverese va forma o copie de tip ADN ce se va introduce într-un alt loc din ADN.

Repetiţiile de secvenţe simple (SSRs, de la Simple Sequence Repets) sunt reprezentate în special de microsateliţ, repetiţii scurte (n=1-13 pb) şi minisateliţi, repetiţii mai lungi (n=14-500 pb).  SSRs sunt produse foarte probabil prin devieri frecvente de împerechere (slippage=alunecare, patinare) în cursul replicării ADN. Formează circa 3% din genom, cele mai frecvente fiind repetiţiile dinucleotidice (0.5%) în special AC şi AT; se găsesc câte una la fiecare 2kb. 

caracteristică remarcabilă a genomului uman este duplicaţia segmentală  a unor porţiuni/blocuri (1-200kb, majoritatea >10kb) din secvenţa genomică în una sau mai multe locaţii, pe acelaşi cromosom (duplicaţii intracromosomice[7], mai ales pericentromerice) sau pe cromosomi diferiţi (duplicaţii intercromosomice[8]). Ele alcătuiesc circa 5% din genomul uman. Interesant este faptul că multe duplicaţii s-au produs foarte recent în evoluţia spre om, lipsind la specii apropiate.

Secvenţele repetitive au fost considerate „deşeuri” neinteresante. Şi totuşi ele s-au dovedit a fi markeri paleontologici valorosi pentru a înţelege evoluţia populaţiilor umane, selecţia şi mutaţiile. Au permis înţelegerea structurii şi dinamicii cromosomilor. Mai mult, ca agenţi activi,  repetiţiile au remodelat genomul uman, producând rearanjamente care au modificat genele existente (producând mutaţii) sau au creat gene noi. Dacă menţionăm, în final, şi valoarea lor ca instrumente de testare / diagnostic în genetica medicală[9] atunci cu siguranţă nu le vom considera „un gunoi” si va trebui să le acordăm atenţia necesară.

 

ADN  genic

Genomul nuclear este alcătuit din: ADN genic (25 %) şi ADN extragenic (75 %). (Figura 2.9). ADN genic conţine secventele codante si necodante din structura genelor active, fragmentelor de genă sau genelor inactive (pseudogene).

Gena este unitatea de informaţie genetică sau ce codifică un produs primar specific (proteine sau ARN necodant). Structura genelor este foarte complexă (vezi capitolul 3) dar toate genele prezintă o regiune centrală, transcrisă, flancată de două regiuni laterale, netranscrise, cu rol reglator. Regiunea centrală („cadru de lectură” sau ORF de la „open reading frame”) este fragmentată în secvenţe codante (exoni) separate de secvenţe necodante, intercalare (introni). ADN genic se împarte deci în  ADN codant (10 %) (reprezentat de exonii celor circa 35.000 de gene ce codifică proteine sau alte molecule de ARN)  şi ADN necodant (90%) alcătuit din introni, gene sau fragmente de gene nefuncţionale (pseudogene).

            Genele sau cel puţin regiunile lor codante alcătuiesc numai o mică fracţiune din genomul uman (mai putin de 5 %) dar ele reprezintă funcţia biologică majoră a genomului şi scopul final al proiectului. Identificarea lor este însă o sarcină dificilă mai ales datorită dimensiunilor mici ale exonilor. Genele genomului nuclear se pot împărţi în două categorii: gene ce codifică proteine şi gene ce codifică diferite clase de ARN necodant.

            Gene ce codifică proteine reprezintă circa 1,5 % din genom. Studiile IHGSC au arătat că: există o variaţie considerabilă în mărimea genelor (în special pe seama intronilor) precum şi în distribuţia lor: regiunile bogate în GC (din benzile G negative) au o mare densitate genică iar genele sunt mai compacte comparativ cu regiunile bogate în AT (benzile G pozitive), mai sărace în gene; densitatea genelor este mai mare în regiunile subtelomerice iar unii cromosomi (de ex., 19 şi 22) sunt mai bogaţi în gene decât alţii (de ex., 4 şi 18). Un element remarcabil este faptul că aproximativ 35% din genele umane suferă matisare alternativă, generând, prin selecţia exonilor, mai mulţi produşi  diferiţi structurali şi funcţionali (deci cele circa 35000 de gene produc aproape un număr triplu de proteine). Un procent din genele umane exprimate sunt membri ai unor familii de gene care prezintă o mare similitudine a secvenţei, structurii si funcţiei lor (vezi capitolul 3).  

            Genele pentru ARN necodant (ncARNs)  sunt împărţite (după IHGSC, 2001) în mai multe clase majore: (1) gene pentru ARN de transfer (tARN); (2) gene pentru ARN ribosomal (rARN); (3) gene pentru ARN nucleolar mic (snoARN) necesar procesării rARN; (4) gene pentru ARN nuclear mic (snARN) ce intervin în procesarea intronilor.  Mai există şi alte tipuri: ARN telomeraza, Xist transcript etc.

 

2.4. ADN   extragenic

            ADN extragenic (75%) este alcătuit din secvenţe inactive transcripţional, unice sau repetitive.  Secvenţele repetitive au fost  clasificate (Strachan si Read, 1999) în două categorii:

ADN repetat în tandem şi grupat în “blocuri” cu difertite localizări cromsomice; această categorie de ADN înalt repetitiv se numeşte generic ADN satelit şi se subîmparte în patru clase: megastelit, satelit, minisatelit şi microsatelit;

ADN repetat şi dispersat în numeroase situsuri în spaţiul dintre gene; este reprezentat de  scvenţele SINEs şi LINEs.

 

3. GENOMUL  MITOCONDRIAL.

 

Genomul mitocondrial este definit printr-un singur tip de ADN circular, bicatenar (figura 2.10), format din 16.569 pb. Secvenţa sa nucleotidică a fost complet descifrată (Anderso et al, 1981) şi se caracterizează printr-o mare densitate de secvenţe codante. Cele două catene ale ADN mitocondrial au o compoziţie bazică diferită: o catenă "grea" (H) este mai bogată în guanină iar cealaltă catenă "uşoară" (L) în citozină. Într-o mică regiune, bucla D, ADN este alcătuit din trei catene, prin sinteza unei piese scurte adiţionale la catena H, cunoscută ca ADN 7S.

Fiecare celulă umană conţine câteva mii de copii ale ADN mitocondrial (ADNmt) şi de aceea cantitatea lui totală, raportată la ADN unei celule somatice, poate reprezenta până la 0.5%. În cursul diviziunilor celulare mitotice, moleculele de ADN mitocondrial ale celulei iniţiale segregă la întâmplare  în celulele fiice.

Trebuie subliniat că genomul mitocondrial al zigotului provine exclusiv de la ovul, deci de la mamă, fapt ce determină un tip particular de transmitere maternală a genelor mitocondriale: de la mamă la toţi copiii săi.

Genomul mitocondrial mai prezintă cîteva elemente particulare, diferite de genomul nuclear: NU este asociat cu proteine histonice sau nehistonice şi nu conţine ADN repetitiv (tabelul 2.1). Genomul mitocondrial  este extrem de compact: circa 93% din ADN esre format din secvenţe codante (absente doar în bucla D), ce formează 37 de gene (28 pe catena H şi 9 pe catena L): 13 gene codifică polipeptide (constituienţi ai sistemului de fosforilare oxidativă), 22 gene codifică ARNt şi 2 gene ARNr (figura 2.13). Restul proteinelor mitocondriale sunt codificate de gene nucleare, sintetizate în citoplasmă şi importate în mitocondrii. Genele mitocondriale sunt aproape totdeauna contigue iar unele chiar suprapuse; ele nu conţin introni.

Transcripţia începe în promotorii (PH şi PL) aflaţi în bucla D, este continuă (deci multigenică) şi se desfăşoară în direcţii diferite pe cele două catene, generând un transcript multigenic mare (ce va fi ulterior secţionat în mai multe molecule de ARN). Codul genetic mitocondrial diferă puţin de cel nuclear. El are patru codoni stop (nonsens) din care doi sunt codoni sens în ADN nuclear; codonul stop UGA din ADN nuclear este codon sens în ADN mitocondrial. Replicarea este unidirecţională şi începe în puncte diferite de origine (O) p entru cele două catene[10].

Diferenţele dintre structura şi funcţia lor sunt prezentate sintetic în tabelul 2.1

 

Tabelul 2.1 Diferenţele dintre genomurile umane nuclear şi mitocondrial

(modificat după Strachan şi Read, 1999)

Caracteristici	Genom  nuclear	Genom  mitocondrial
Mărime	3200 Mb	16,6 Kb
Număr de molecule de ADN diferite	23 (la celulele XX) sau 24 (la celulele XY)	O moleculă circulară de ADN
Număr total de molecule de ADN per celulă	23 în celulele haploide şi 46 în celulele diploide	Câteva mii de
Asocierea cu proteine	Mai multe clase de histone şi proteine nehistonice	Neasociat cu proteine
Procentul de ADN codant	~ 5 %	~ 97 %
Număr de gene	~ 35.000 gene	37
Densitatea genelor	Mică (~ 1 la 40 kb)	Mare (~ 1 la 0.45 Kb)
Introni	Prezenţi în cele mai multe gene	Absenţi
ADN repetitiv	30 – 40 %	Foarte puţin
Transcripţie	Deobicei individuală	Transcripţie continuă a genelor multiple
Repararea leziunilor ADN	Mecanisme multiple, eficientă	Unele mecasnisme de reparare absente; mutaţiile se acumulează rapid.
Recombinare	Cel putin una pentru fiecare pereche de cromosomi meiotici	Absentă
Ereditate	Mendeliana pentru genele de pe autosomi şi cromosomul X; paternală pentru secvenţele de pe Y	Exclusiv maternă

 

            ADN mitocondrial poate suferi mutaţii[11] producând o serie de boli degenerative (vezi capitolul 8), care sunt transmise într-un mod specific, de la mamă la toţi descendenţii; bărbaţii bolnavi nu transmit boala. Atunci cînd se produce o mutaţie în ADN mitocondrial rezultă în mitocondrie un amestec  de molecule mutante şi normale, numit heteroplasmie. Cînd o celulă se divide ADN mitocondrial mutant va fi împărţit la întâmplare între celulele fiice şi astfel, în timp, procentajul de ADN mit mutant între diferite linii celulare şi ţesuturi va fi diferit, fenomen numit segregare replicativă.             Studiul familiilor în care există heteroplasmie cu ADN mitocondrial mutant, relevă că procentajul ADNmt mutant creşte şi producţia de energie scade treptat, până sub un prag minimum necesar funcţionării normale a ţesutului, moment în care manifestările clinice devin evidente. De aceea bolile mitocondriale au un debut tardiv şi o evoluţie progresivă.

            S-a demonstrat că ADN mitocondrial poate suferi mutaţii somatice, în celulele corpului după naştere, care se acumulează rapida datorită absenţei unor mecanisme de reparare. Astfel, aceste mutaţii somatice au probabil un rol important atât în debutul şi progresia bolilor mitocondriale, a unor boli degenerative precum şi în procesul de senescenţă.

 

SCHIŢA  secvenţei genomului uman

 

La 15 februarie 2001 a fost publicată „Schiţa genomului uman”. Acest lucru a fost realizat concomitent de International Human Genome Sequencing Consortium (un proiect public început în 1990, ce implică 20 de laboratoare şi sute de cercetători din întreaga lume) şi de Celera Genomics, o companie privată. Ambele schiţe prezintă secvenţa a circa 96% din regiunile eucromatice ale cromosomilor umani.

Mărimea totală estimată a genomului uman este de 3,2 Gb (gigabase), din care 2,95Gb reprezintă eucromatina. Secvenţele codante curpind mai puţin de 5% din genom  iar numărul prognozat de gene este cuprins între 30.000 şi 35.000. Acest număr este relativ mic dacă îl comparăm cu 6.000 la o celulă de drojdie, 13.000 la drosofilă, 18.000 la un vierme şi 26.000 pentru o plantă. Se pune firesc întrebarea: cine face diferenţa dintre om şi mamiferele superioare (de ex. Cimpanzeul), ca să nu vorbim de celelalte organisme multicelulare. Este posibil un răspuns dacă comparăm…proteinele. Se estimează că genomul uman codifică 1.278 de familii de proteine dar numai 89 sunt specifice vertebratelor! (realizând complexitatea neuronală, coagularea sângelui, imunitatea, semnalizarea intra- şi intercelulară, dezvoltarea, apoptoza etc). Cele mai multe dintre funcţiile celulare – metabolismul bazal, transcripţia şi translaţia, replicarea, diviziunea – se realizează la fel ca la bacterii sau organismele unicelulare. Diferenţa majoră între om şi nevertebrate o reprezintă complexitatea proteinelor, structura lor modulară (pe domenii şi motive), care permite combinaţii noi. “Istoria omului este de fapt o arhitectura nouă realizată cu piese vechi” (Baltimore D., 2001). La aceasta se adaugă interacţiunile complexe dintre proteine, mecanismele subtile de reglare a sintezei lor si nu în cele din urmă  posibilităţile de a produce  proteine diferite  pe baza informaţiei dintr-o singură genă (matisare alternativă). Cert este că a înţelege cine determină enorma complexitate a fiinţelor umane rămâne o enigmă de rezolvat în viitor.

Ar mai fi o întrebare la fel de tulburătoare: ce deosebeşte un organism uman de altul, evident la nivelul genomului, facându-ne pe fiecare unici? Analiza schiţei genomului uman arată că oamenii diferă între ei prin circa o pereche de baze la fiecare mie de pb. Acest polimorfism al unui singur nucleotid (SNPs de la single nucleotid polymorphisms) reprezintă markerii noştri de individualitate cei mai valorosi, care determină probabil (dar nu stim cum) şi răspunsul la agresiuni (boala) şi efectele medicamentelor iar la scara mai mare abilitatea, memoria, coordonarea fizică, creativitatea etc. Cunoaşterea aprofundată a genomului uman ne va permite să invăţăm multe din această carte a vieţii.

Din multitudinea datelor ce însoţesc „Schiţa secvenţei genomului uman” vom sublinia câteva idei mai importante.

Peisajul genomic prezintă o mare variabilitate în distribuţia unor caractere: gene, elemente transpozabile, conţinut de GC,  distribuţia insulelor CpG, rata recombinărilor în meioză;

Cele circa 35.000 de gene[12] au o structură mai complexă ca la alte vertebrate şi au posibilităţi de a genera  (prin matisare alternativă) un număr mare de proteine;

Întregul set de proteine (proteom) codificat de genomul uman este mai complex decât la nevertebrate; ele au domenii şi motive care pot fi aranjate în diferite structuri;

Există regiuni bogate şi sărace în GC, care se corelează pozitiv cu densitatea genelor, benzile cromosomice, compoziţia secvenţelor repetitive, rata recombinărilor.

Genele sunt distribuite inegal în genom. Unii cromosomi (de ex., 17, 19, 22) au o densitate mare de gene comparativ cu alţii (de ex., 4, 8, 13, 18 şi Y).

Insulele CpG (în care nu se produce metilarea) se află frecvent la capătul 5’ al genelor;

Rata de recombinare meiotică între cromosomii omologi este mai mare pe breţele scurte, mare la capătul cromosomilor şi absentă la centromer;

Rata mutaţiilor este de două ori mai mare în meioza masculină decît la femeie, deci cele mai multe mutaţii se produc la bărbat;

Au fost identificate mai mult de 1,4 milioane de SNPs ce prezintă un polimorfism foarte mare între indivizii unei populaţii (rata de heterozigozitate este de 1 la 1300 pb);

Mai mult de jumătate din ADN reprezintă secvenţe repetitive de diferite tipuri. Este totuşi puţin probabil că  tot acest “junk ADN” (deşeu/gunoi) reprezintă elemente “egoiste” ce parazitează genomul  uman (el aproape lipseşte la vertebratele inferioare). Cu siguranţă el a avut si mai are efecte negative dar si pozitive. Foarte probabil însă aproape toate aceste repetiţii parazitice de ADN par vechi şi epuizate deoarece există puţine probe că ele îşi continuă reinserţia în prezent.

            Rezultatele publicate de Consortiul International vizează şi alte domenii: analiza proteomului, istoria şi evoluţia genomului uman, aplicaţiile în medicină şi biologie. Ne vom referi succint la ultimul  aspect. O aplicaţie esenţială a cercetării genomului uman o reprezintă abilitatea de a găsi gene cu funcţii biochimice necunoscute. Deasemeni, analiza secvenţei genomului uman a permis identificarea mecanismelor ce duc la sindroamele cu microdeleţii cromosomice (de ex. sdr. Velo-Cardio-Facial sau sdr Williams-Beuren) precum şi la identificarea rapidă a genelor paraloge de boală, adică a unor gene înrudite care produc boli asemănătoare (de ex. genele pentru presenilina-1 şi presenilina-2 în care mutaţiile produc o formă de boală Alzheimer cu debut precoce. Aceasta va genera noi optiuni terapeutice.

            În concluzie, publicarea primei schite a secvenţei genomului uman (februarie 2001) reprezintă un progres considerabil dar mai sunt încă multe de făcut până la finalizarea proiectului şi extragerea tuturor informaţiilor din cunoaşterea acestei secvenţe pentru a înţelege cum funcţionează genomul uman.

            Vom menţiona în încheiere că se cunoaşte secvenţacompletă a ADN din cromosomii 20, 21 şi 22.

 

D.  ORGANIZAREA   ADN   ÎN   CELULĂ

 

            1. APARATUL GENETIC

 

            Structurile celulare care conţin ADN (nucleul şi mitocondriile), precum şi cele care intervin în realizarea funcţiilor sale (ribosomii şi centriolii) alcătuiesc aparatul genetic. Nucleul este elementul principal al aparatului genetic, centrul de comandă şi control al tuturor activităţilor celulare. El conţine circa 99.5 % din toată cantitatea de ADN a celulei.

            Structura nucleului diferă în interfază şi diviziune, cele două etape importante ale ciclului de viaţă al celulei. Fără a intra acum în detalii (vezi capitolul 5.B.1) vom preciza că interfaza este alcătuită (figura 2.11) din: faza G₁ – presintetică, în care cromosomii despiralizaţi sunt monocromatidieni şi au au o singură moleculă de ADN iar conţinutul total al ADN este 2C; faza S – în care se produce sinteza ADN, prin replicare semiconservativă, şi cantitatea de ADN a celulei se dublează la 4C; faza G₂ – postsintetică, în care cromosomii sunt bicromatidieni, fiecare cromatidă fiind alcătuită dintr-o singură moleculă de ADN. Prin diviziunea (mitoza) se produce, prin disjuncţie (separare) cromatidiană, distribuţia (segregarea) egală şi totală a materialului genetic dublat în faza S.

            Nucleul interfazic  este delimitat la exterior de o membrană dublă, cu pori (prin care se realizează schimburile nucleo-citoplasmatice); în interiorul nucleului se află: un nucleoschelet sau matrice nucleară (formată din ARN şi proteine, în special actină), cromatină, nucleoplasmă şi nucleol(i) (cu rol esenţial în formarea  ribosomilor).

            În nucleu, fiecare moleculă de ADN se asociază cu pro  teine histonice, nehistonice şi mici cantităţi de ARN, formând un complex nucleo-proteic numit cromatină. Interacţiunile dintre ADN şi proteine au un rol structural fundamental în organizarea supramoleculară a ADN, precum şi un rol funcţional în mecanismele complexe care reglează expresia şi replicarea genelor. Relaţiile complexe dintre ADN şi proteine nu sunt încă complet elucidate.

 

 

      Caseta 2.2

Proteinele histonice şi nehistonice

 

Histonele sunt proteine bazice prezente la toate eucariotele, cu mare afinitate pentru ADN, fixându-se pe mica incizură şi neutralizând sarcinile acide. Raportul ADN – histone este egal cu 1. Genele care codifică histone au o structură particulară (fără introni), se află în mai multe exemplare (peste 20), localizate pe cromosomii 1, 6, 12. Se exprimă în faza S a ciclului celular, sincron cu replicarea ADN. După numărul şi tipul de aminoacizi se deosebesc cinci tipuri de histone prezente la toate eucariotele: H1, H2A, H2B, H3 şi H4. Cu excepţia histonei H1, celelalte tipuri (şi mai ales H3 şi H4) au o structură stabilă, bine conservată în evoluţie. Acest lucru relevă rolul structural important pe care îl au aceste proteine în organizarea supramoleculară a ADN şi compactarea lui în nucleu. Ele intră în alcătuirea nucleosomilor, particule fundamentale din structura fibrelor de cromatină. Histonele au însă şi roluri funcţionale, fiind implicate în reglarea expresiei genelor (transcripţie): acetilarea histonelor determină activarea unor gene, iar metilarea lor produce represia genică. Fosforilarea histonei H1 provoacă condensarea fibrelor de cromatină interfazică în cromosomi şi declanşează mitoza. O dovadă recentă a rolului funcţional al histonelor este descoperirea histonei H1⁰ (numită şi H5) care lipseşte în celulele care se divid şi apare în celulele diferenţiate sau celule în faza G₀. Au fost identificate şi alte variante funcţionale. Astfel histona H2AZ, cu rol important în reglarea transcripţiei, este o variantă larg răspândită la nivelul cromosomilor, dar neumiform. CENP-A este o proteină înrudită cu H3 care are rol major în activitate centromerilor.

Proteinele nehistonice sunt proteine acide şi neutre, numeroase, heterogene şi puţin abundente; o excepţie face grupul proteinelor HMG ("high mobility group"). Unele proteine nehistonice au un rol structural formând "matricea" cromosomilor dar majoritatea au roluri funcţionale, intervenind specific în reglarea sau modularea activităţii genelor. Ele se fixează la ADN în marea incizură laterală. Proteinele HMG participă probabil la reglarea replicării ADN.

 

            Moleculele de ADN şi histone suferă spiralizări succesive, alcătuind un sistem ierarhizat de fibre de cromatină, de dimensiuni diferite. Ele realizează "compactarea" moleculelor lungi de ADN în spaţiul nuclear, care nu depăşeşte câţiva microni în diametru.

            La începutul diviziunii, membrana nucleară şi nucleolii dispar, iar fibrele de cromatină se spiralizează, se condensează şi formează cromosomii; la sfârşitul diviziunii aceştia se despiralizează şi persistă în interfază sub forma filamentelor de cromatină.Cromatina şi cromosomii sunt două modalităţi diferite de organizare morfofuncţională a materialului genetic, în interfază şi diviziune.

O dovadă elegantă a acestei afirmaţii o reprezintă "fenomenul de condensare prematură a cromosomilor". El se realizează prin fuzionarea experimentală a unei celule în diviziune (metafază) cu o celulă interfazică (în faza G1, S sau G2). Se produce o "sincronizare" a celulei interfazice şi o condensare precoce a filamentelor fine de cromatină, care vor prezenta toate detaliile morfologiei cromosomilor, fiind monocromatidieni, dacă celula se află în G1 sau bicromatidieni dacă inducerea condensării s-a făcut în faza G2 (pentru celulele în faza S condensarea precoce determină un aspect "pulverizat" al cromatinei). De menţionat că prin tehnica condensării precoce a cromosomilor pot fi vizualizaţi şi analizaţi cromosomii gameţilor, celule interfazice.

           

            2. CROMATINA

 

            Asocierea obligatorie dintre ADN nuclear şi proteine se numeşte cromatină. În diferite stadii ale ciclului celular cromatina prezintă diferite grade de condensare şi se prezintă sub două tipuri morfo-funcţionale distincte: eucromatina şi heterocromatina (tabel 2.2)

 

Tabelul 2.2.  Caracteristicile eucromatinei şi heterocromatinei.

Caracteristici	EUCROMATINA	HETEROCROMATINA
Condensare	Fin dispersată	Puternic condensată (cromocentri)
Colorare	Slabă	Intensă
Replicare în faza S	Precoce	Tardivă
Activitate genetică	Activă	Inactivă
Compoziţie chimică	Predomină  p.b. C – G; ADN nerepetitiv;   proteine nehistonice	Predomină p.b. A – T; ADN repetitiv;   proteine histonice

 

            2.1. EUCROMATINA  ŞI  HETEROCROMATINA

            Eucromatina are mai mult ADN nerepetitiv, în care predomină perechile de baze G-C, şi proteine nehistonice; este puţin condensată şi reprezintă partea activă genetic (transcripţională) a cromatinei; se replică precoce la începutul fazei S. Alcătuieşte benzile R pozitive din cromosomii cu marcaj în benzi.

            Heterocromatina, are mai mult ADN repetitiv (în care predomină p.b. A-T) şi histone, este foarte compactată (condensată sub formă de cromocentri), inactivă genetic, cu replicare tardivă. Deşi inactivă genetic (transcripţional), heterocromatina îndeplineşte cu siguranţă anumite funcţii celulare. Se presupune că heterocromatina stabilizează centromerul şi telomerele cromosomului, intervine în desfăşurarea meiozei (în sinapsa cromosomilor omologi) şi, probabil, în diferenţierea celulară. Heterocromatina este de două feluri: constitutivă şi facultativă

Heterocromatină constitutivă care se găseşte constant sub formă condensată. Ea nu conţine gene funcţionale, şi este formată din  ADN înalt repetitive (ADN satelit). În structura cromosomului, heterocromatina constitutivă se află în regiunea centromerului, pe braţul lung al cromosomului Y, pe braţele scurte ale acrocentricilor şi în constricţiile secundare. Ea poate fi evidenţiată în cromosomii metafazici, printr-un tratament specific, sub forma unor benzi numite benzi C.

Heterocromatină facultativă care diferă la celule diferite şi chiar la organisme diferite: în unele celule anumite gene sau părţi din cromosomi pot fi active; în alte celule, aceleaşi structuri pot să nu funcţioneze, fiind sub formă de heterocromatină. Astfel, heterocromatinizarea ar interveni în reglajul genic. Exemplul cel mai tipic îl constituie cromatina sexuală; unul din cei doi cromosomi X la organismele de sex feminin este inactivat formând cromatina X. Procesul se produce la întâmplare şi independent în fiecare celulă

 

            2.2. CROMATINA SEXUALĂ

            Cromatina sexuală reprezintă un cromocentru cu particularităţi morfologice bine definite, care permite stabilirea numărului de cromosomi sexuali şi, prin aceasta, determinarea sexului genetic (XX sau XY) şi anomaliilor numerice ale cromosomilor sexuali.

            Cromatina sexuală se prezintă diferit la femeie şi la bărbat, deoarece rezultă prin mecanisme diferite.

La femeie (XX), cromatina sexuală se formează prin inactivarea unuia din cei doi cromosomi X, care formează un corpuscul de heterocromatină numit corpuscul Barr sau cromatină X.

La bărbat (XY) cromatina sexuală reprezintă heterocromatina braţului lung al cromosomului Y, care se vizualizează la microscopul în fluorescenţă prin afinitatea particulară pentru diferite substanţe fluorescente (în special quinacrină); de aceea se mai numeşte corpusculul F sau cromatina Y.

            a). Cromatina X  (Barr şi Bertram, 1949)

            Aşa cum am precizat şi vom discuta ulterior în detaliu (vezi capitolul 4.B.4), cromatina X rezultă la femeile XX prin inactivarea unuia din cei doi cromosomi X, care prin condensare (heterocromatinizare) va forma corpusculul Barr. În felul acesta, atât la femeie cât şi la bărbat, va rămâne numai un singur X rămâne funcţional; la ambele sexe, toţi cromosomii X în plus vor fi heterocromatinizaţi. Potrivit ipotezei Lyon (1961), inactivarea cromosomului X este totală, se produce precoce în perioada embrionară şi este definitivă, pentru toată viaţa. Procesul de inactivare a unuia din cei doi cromsomi X (de origine maternă şi paternă) se produce la întâmplare şi independent în fiecare celulă.

            Cromatina X, se poate evidenţia pe frotiuri realizate cu celulele diferitelor mucoase (de obicei mucoasa bucală), pe frotiuri de sânge (în polimorfonuclearele neutrofile), în bulbul pilos, în celule amniotice şi în celule obţinute prin biopsia diferitelor organe.

            În celulele epiteliale ale mucoasei bucale, cromatina X se prezintă sub forma unui corpuscul (cromocentru) intens colorat bazofil, situat de obicei pe faţa internă a membranei nucleare, ovalar sau plan convex, cu mărime medie de un micron (±0.3), numit corpusculul Barr (figura 2.12.a). Prin caracteristicile sale el poate fi deosebit de nucleol sau alţi cromocentri nespecifici. Teoretic, toţi nucleii celulelor provenite de la persoane normale de sex feminin ar trebui să aibă un corpuscul Barr. În practică, procentul celulelor "cromatin X pozitive" este cuprins între 15-35 % datorită: calităţii improprii pentru analiză a unor nuclei, şi probabil, acţiunii unor factori celulari care produc decondensarea cromosomului X fără a afecta însă inactivarea lui. Numărul de corpusculi Barr este egal cu suma cromosomilor X – 1. În felul acesta, pe baza numărului de corpusculi Barr se poate preciza numărul cromosomilor X şi diagnostica[13], simplu şi repede, sexul genetic  şi diferite anomalii numerice: X0, XXX, XXY, etc. (figura 2.13).

            În polimorfonuclearele neutrofile (PMN) cromatina X se poate prezenta sub forma unor apendici nucleari, fie "în băţ de tobă" (apendice tip A), fie ca un "nodul sesil" (apendice de tip B) (figura 2.12.b). Pentru un diagnostic corect ei trebuie deosebiţi de alţi apendici nesexuali. Numărul apendicilor sexuali este, ca şi în cazul corpusculului Barr, egal cu suma cromosomilor X minus 1.

            b). Cromatina Y

            În celule prelevate de la o persoană de sex masculin (XY) se poate evidenţia prin coloraţia cu diferiţi fluorocromi (quinacrină) şi examinare microscopică în lumină ultravioletă, un corpuscul intens fluorescent, numit corpuscul F (figura 2.12.c). El reprezintă aspectul interfazic al celor 2/3 distale a braţului lung al cromosomului Y, alcătuite din heterocromatină intens fluorescentă. Mărimea medie a corpuscului F este 0.25 microni, iar numărul de corpusculi F este, firesc, egal cu numărul cromosomilor Y.

 

            2.3. STRUCTURA SUPRAMOLECULARĂ  A  CROMATINEI

            Analiza cromatinei la microscopul electronic evidenţiază un sistem ierarhizat de fibre de cromatină, de dimensiuni diferite (figura 2.14), alcătuite din ADN, histone şi proteine nehistonice.

            Primul nivel de organizare supramoleculară a ADN  este filamentul cu nucleosomi, cu diametrul de 10 nanometri (nm). Nucleosomul este alcătuit dintr-un complex de ADN şi histone (figura  2.15.a): o secvenţă de ADN (de 146 p.b.) se înfăşoară (1 tur şi 3/4) în jurul unui "miez" histonic, cilindric, formată din 8 molecule de histone (câte 2 molecule din H2A, H2B, H3 şi H4). Nucleosomii sunt legaţi între ei printr-un segment de ADN liber (60 p.b.), formând filamentul cu nucleosomi, asemănător unui "şirag de mărgele". Această structură (menţinută strâns prin histona H1, ce leagă doi nucleosomi vecini) realizează o rată de "împachetare" a ADN nativ (dublu helix de 2nm) de circa 10:1.

Mecanismul prin care se formează nucleosomii este încă puţin cunoscut. Cert este faptul că nucleosomii nu sunt structuri statice, rigide, deoarece funcţiile ADN (transcripţia, replicarea, recombinarea) necesită separarea celor două catene ale ADN şi implicit modificarea structurii nucleosomului. Ei sunt fixaţi la o singură catenă a ADN ("în fază") aceiaşi de la o celulă la alta.

            Al doilea nivel de organizare supramoleculară a cromatinei este fibra de cromatină de 30 nm. Ea rezultă din spiralizarea în solenoid a filamentului cu nucleosomi (figurile 2.14 şi 2.15.b). Această structură (cu pasul de 6 nucleosomi) este stabilizată de histona H1 şi realizează o compactare de 5:1. Fibra de cromatină de 30 nm este unitatea fundamentală de organizarea cromatinei în nucleul interfazic.

Fibra de cromatină are însă şi un rol important pentru funcţionarea genomului, deoarece prin spiralizare apropie mult diferite regiuni ale ADN care, liniar, se află la distanţe mari unele de altele. În felul acesta, favorizează interacţiunile genice necesare pentru expresia adecvată a informaţiei ereditare. Mai mult, solenoidul nu are o structură omogenă: zonele spiralizate alternează neregulat cu zone nespiralizate, unde se pot fixa o serie de proteine specifice, care produc o configuraţie cromatiniană ce permite accesul ARN polimerazei şi deci transcripţia.

            Al treilea nivel de organizare rezultă prin plierea fibrei de cromatină de 30 nm în bucle laterale, numite şi domenii, de lungimi diferite (20-100 kb); se formează fibra pliată în bucle laterale cu un diametru de 300 nm (grad de compactare 10:1). Buclele sunt ataşate, prin anumite situsuri de ancorare[14] din structura fibrei de ADN, la un "schelet" sau matrice proteică (nonhistonică[15]) (figura 2.14), care are o formă identică cu cea a cromosomului metafazic. Se consideră că fiecare buclă sau domeniu (ce conţine câteva gene) ar putea fi o unitate funcţională de transcripţie şi replicaţie; buclele au deci atât o semnificaţie structurală cât şi un rol funcţional important.

            Fibra pliată în bucle laterală formează la începutul profazei, printr-o puternică spiralizare şi condensare (grad compactare 20), cromatida unui cromosom (figura 2.14). Ea atinge în metafază o grosime de 700 nm, fiind cel mai înalt grad de compactare a fibrei de bază a cromatinei (30 nm). Fiecare cromatidă a unui cromosom conţine deci o singură moleculă de ADN, organizată în mai multe structuri succesive şi ierarhizate de "împachetare". La sfârşitul diviziunii, în telofază, se produce despiralizarea/decondensarea cromosomilor.

            Relaţia dintre ADN, fibrele de cromatină şi cromosomi se poate reda sintetic astfel:

 

            ADN   ->  FILAMENT    ->     F I B R A      ->   F I B R A     ->      CROMATIDA

                                     CU                         DE                   P L I A T Ă                    UNUI

                           NUCLEOSOMI       CROMATINĂ      Î N  BUCLE            CROMOSOM

                             ___________________________________________        ______________

                                                           INTERFAZA                                             DIVIZIUNE

 

            Molecula de ADN suferă astfel o compactare de 10.000 de ori şi poate încape facil în spaţiul mic, de câţiva microni, al nucleului. Acest fenomen favorizează distribuţia corectă a materialului genetic în diviziune şi asigură funcţionarea ADN.

            Înainte de a încheia prezentarea acestor fenomene vom sublinia un alt fapt important. Buclele fibrei de 300 nm se fixează neregulat de scheletul proteic. Din loc în loc (în regiuni de ADN în care predomină secvenţe cu p.b. A-T) ele formează mici aglomerări de bucle, numite cromomere, separate prin zone mai laxe (figura 2.16). Pe măsură ce cromosomul profazic se condesează cromomerele mici, vecine, se unesc într-o structură mai mare. Aceste cromomere mari se adună în grămezi şi formează benzi intens condensate şi colorate (benzi G); ele vor fi separate prin benzi mai puţin condensate şi mai clare (benzi R).

ADN care formează  benzile G (sau Q) conţine mai multe puncte de ataşare, strâns apropiate, iar buclele sunt mai dense, mai compactate; coloranţii (Giemsa, Quinacrină) care au afinitate pentru regiunile SAR bogate în A-T vor da benzi G. In benzile R densitatea punctelor de ataşare este mai mică, buclele sunt mai laxe.

            Benzile cromosomice reflectă structura internă heterogenă a cromosomului şi definesc regiuni din genom care au proprietăţi şi funcţii diferite .

 

            3. CROMOSOMII UMANI

 

            La începutul diviziunii cromatina se organizează în cromosomi,  organite nucleare care fixează intens coloranţii bazici ("chroma" – culoare; "soma" – corp) şi îndeplinesc două funcţii importante:  transportă materialul genetic de la părinţi (prin gameţi) la descendenţi, precum şi de la o celulă "mamă" la celulele "fiice" în cursul multiplicării celulare, asigurând stabilitatea proceselor ereditare; realizează amestecul materialulului ereditar între generaţii succesive, prin procesele de recombinare ce au loc în meioză, sursa principală de variabilitate

            Anomaliile de număr şi structură ale cromosomilor sunt implicate în numeroase stări patologice (vezi capitolul 10) şi deaceea explorările citogenetice reprezintă o metodă importantă de diagnostic în medicina clinică (sindroame plurimalformative, debilităţi mintale şi tulburări de comportament, tulburări de sexualizare şi reproducere, cancer). Orice medic practician trebuie să aibă cunoştinţe precise despre metodele de studiu, indicaţiile şi limitele analizei cromosomice precum şi priceperea de a interpreta corect rezultatele explorărilor citogenetice.

 

            3.1. MORFOLOGIA CROMOSOMILOR UMANI

            Numărul şi morfologia cromosomilor sunt elemente caracteristice pentru fiecare specie.  La om, în celulele somatice diploide, există în mod normal 46 de cromosomi, iar în gameţi (celule haploide) doar 23 de cromosomi. După fecundare, la zigot, se reface numărul diploid şi se realizează 23 perechi de cromosomi omologi, identici ca mărime, formă şi conţinut genic[16] – dar diferiţi ca origine. 22 perechi de cromosomi sunt identice la cele două sexe şi se numesc autosomi; o pereche diferă însă la cele două sexe, numindu-se cromosomi sexuali sau gonosomi: XX la femeie şi XY la bărbat. Cromosomii X şi Y sunt omologi doar ca origine şi funcţie, ambii având un rol important în determinismul sexelor; ei se deosebesc morfologic (cromosomul Y fiind mult mai mic decât cromosomul X) şi genetic (cromosomul X are şi gene "nesexuale" ce determină diferite caractere ale corpului).

            Cromosomii sunt cel mai uşor de analizat în stadiul de metafază sau prometafază al mitozei (figura 2.17) deoarece se află în acelaşi plan (în "placa ecuatorială") şi sunt bine individualizaţi. În aceste stadii ei sunt alcătuiţi din două cromatide unite la centromer şi delimitate la capete prin telomere (figura 2.18 a). Cromosomii sunt bicromatidieni deoarece în faza S a ciclului celular a avut loc dublarea (replicarea) materialului genetic.

            a). Elementele morfologiceşi funcţionale comune tuturor cromosomilor sunt: cromatidele, centromerul şi telomerele. Ele sunt esenţiale pentru replicarea şi distribuţia cromosomilor în diviziune; de aceea ele nu pot lipsi din structura unui cromosom funţional sau din arhitectura cromosomilor “artificiali” (YAC) care au început să fie “fabricaţi” în scopuri experimentale.

            (1). Cromatidele unui cromosom sunt subunităţi longitudinale identice ("cromatide surori") care posedă fiecare o singură moleculă de ADN asociată cu proteine sau, mai exact, o fibră de cromatină puternic condensată (figura 2.14).  În lungul cromatidelor există, foarte probabi,l secvenţe de replicare autonomă (elemente ARS), bogate în AT, în care se iniţiază replicarea. Localizarea lor nu a fost încă precis definită la om.

            (2). Centromerul este locul în care cromatidele surori sunt ataşate prin intermediul unor proteine, formând constricţia primară. Cromosomii au în mod normal un singur centromer. Poziţia centromerului la fiecare cromosom este  fixă, fiind determinată de o secvenţă particulară de ADN centromeric înalt repetitiv (ADN satelit), aceiaşi la toţi cromosomii; ea formează un bloc de heterocromatină constitutivă, evidenţiat prin marcajul C. La aceasta secvenţă de ADN comună tuturor cromosomilor se poate adăuga o secvenţă specifică fiecărui cromosom (ADN alfoid). La secven’ele centromerice se leagă nişte proteine specifice CENP (A, B, C, D) care sunt probabil implicate în funcţiile centromerului.

            Centromerul împarte cromatidele în două braţe, notate convenţional cu p (de la "petit") pentru braţul scurt şi q (de la “qeue”), pentru braţul lung. După poziţia centromerului, cromosomii pot fi:

metacentrici (cu centromerul în la mijlocul cromosomului şi braţele aproximativ egale),

submetacentrici (cu centromerul în afara zonei centrale şi braţele de lungimi diferite),

acrocentrici (cu centromerul spre un capăt al cromosomului). (figura 2.18 b)

            Centromerul are un rol cheie în diviziunea celulară, în procesul de segregare. Funcţia centromerului este de a asigura distribuţia egală  a fiecărui cromosom,  prin mitoză de la celula “mamă” la “celulele fiice”. În acest proces, ADN centromeric determină fixarea specifică a unor proteine[17] care vor forma kinetocorii, locul de fixare a microtubulilor filamentelor fusului de diviziune (în metafază), care vor asigura tracţiunea şi deplasarea cromatidelor la polii fusului de diviziune (vezi capiolul 5.B.2). Fragmentele cromsomice fără centromer ("acentrice")[18] nu se ataşează la fusul mitotic şi nu vor fi incluse  în nucleii celulelor fiice iar cromosomi dicentrici anormali nu se pot "distribui" corect în diviziune.

Recent s-a stabilit că alipirea celor două cromatide la nivelul centromerului este controlată de proteina ISS (de la Inhibitor of Sister chromatid Separation). Atunci când cromosomii s-au aliniat corect în placa metafazică o enzimă (ubiquitina) produce degradarea bruscă a proteinei ISS şi începe anafaza, cu migrarea cromatidelor surori spre fiecare pol. În absenţa centromerului se pierde controlul distribuţiei cromosomilor în celulele fiice; una din ele poate primi două copii ale cromosomilor acentrici se formează de obicei în celule tumorale o structură numită “double minute chromosomes”

            (3). Telomerele – sunt structuri specializate formate din ADN şi proteine care acoperă capetele cromosomului. Ele prezintă un bloc (3-20 kb) de ADN repetitiv format din secvenţe scurte de (5'-TTAGGG-3'), repetate în tandem, de câteva mii de ori; ele sunt identice la toţi cromosomii şi perfect conservate în evoluţie. Sub acest bloc se găseşte regiunea subtelomerică (TAR de la telomere associated repeats, divizată în două domenii) formată din ADN repetitiv, cu funcţiie încă necunoscute, dar cu o structura 95% identică la alţi cromosomi. Urmează secvenţe de ADN specifice fiecărui cromosom

            Telomerele au următoarele funcţii probabile:

Menţinerea stabilităţii şi integrităţii structurală a cromosomului, apără capetele cromosomilor de degradare şi împiedică fuziunea “cap la cap” cu alţi cromosomi; pierderea telomerelor produce capete cromosomice instabile care au tendinţa de a fuziona cu capetele altor cromosomi rupţi, formînd diferite tipuri de aberaţii structurale.

Recent s-a stabilit că prezenţa telomerelor la capetele cromosomilor serveşte ca semnal de normalitate; dacă în celulă se produce o ruptură cromosomică şi apare un fragment cromosomic această structură anormală este recunoscută de mecanismele de control ale integrităţii ADN şi se produce oprirea temporară a ciclului celular, pentru a permite repararea leziunilor; dacă acest lucru nu este posibil atunci se declanşează apoptoza

Asigurarea replicării complete a capetelor cromosomului. Procesul se realizează cu ajutorul unei telomeraze; reducerea activităţii sale produce o pierdere treptată a secvenţelor telomerice, la fiecare replicare; acest fenomen (ce va fi descris în detaliu în capitolul 5) va duce la scurtarea progresivă a telomerelor, până la un moment critic ce va bloca diviziunea celulei. Aceasta ar putea fi o explicaţie a duratei limitate de viaţă a celulelor somatice. Aşa cum vom vedea, fenomenul de scurtare a telomerelor este implicat în  senescenţă şi cancer (Holt, 1996).

Participare la stabilirea arhitecturii  tridimensionale a nucleului (cromosomii se fixează cu telomerele pe faţa internă a membranei) şi/sau la iniţierea  sinapsei corecte a cromosomilor omologi la începutul profazei meiozei I.

            b). Elemente morfologice comune  unor cromosomi.

            (1). Sateliţii. Cromosomii acrocentrici (exceptând Y) au ataşate la braţele scurte, mici mase de cromatină numite sateliţi. Ataşarea sateliţilor se face prin intermediul unor filamente ce conţin  genele pentru ARN ribosomal (bogat reprezentat în nucleol); de aceea ele se numesc şi organizatori nucleolari.

            (2). Constricţiile secundare (notate convenţional cu "h") se găsesc pe cromosomii 1, 9 şi 16, pe braţul lung lângă centromer. Sunt alcătuite din ADN repetitiv.

            (3). Situsurile fragile. Uneori pe cromatidele cromosomilor se observă nişte "lacune" necolorate în care cromosomii se pot rupe mai uşor, in vivo sau în anumite condiţii de cultură (folosirea unor antifolaţi sau aphidicolin, un inhibitor specific al ADN polimerazei). Aceste zone de rezistenţă scăzută, situate într-un punct specific în lungul cromosomului, se numesc situsuri fragile. Majoritatea situsurilor fragile sunt considerate markeri normali. Excepţie face un situs fragil FRAXA situat pe braţul lung al cromosomului X (Xq27), asociat frecvent cu debilitate mintală (sindromul X fragil). Studii recente sugerează că unele situsuri ar putea avea un rol în progresia tumorală: rupturile în aceste situsuri produc inactivarea unor gene supresoare de tumori.

            c). Benzile cromosomice, elemente specifice fiecărui cromosom

            Prin diferite tratamente (digestie enzimatică, denaturare termică etc) şi/sau încorporarea unor coloranţi specifici pentru ADN (Giemsa, Quinacrină etc), cromosomii metafazici apar alcătuiţi dintr-o serie continuă de benzi longitudinale, în care zone  intens colorate (benzi G) alternează  regulat cu altele mai  slab colorate (benzi R). Fiecare cromosom are un model caracteristic al poziţiei, succesiunii, mărimii şi intensităţii benzilor, ce permite identificarea sa precisă (figura 2.19). Acest model este identic în toate celulele corpului şi la toţi indivizii speciei[19]. Mărimea benzilor este cuprinsă între 1-10 Mb.

            Benzile sunt markeri citologici ai structurii interne heterogene a cromosomilor; ele reflectă în primul rând gradul de compactare (condensare) a fibrei de cromatină în lungul cromosomilor; Benzile se corelează în mare măsură şi cu organizarea funcţională a cromosomilor, deoarece definesc o distribuţie alternativă a eucromatinei (benzi R) şi heterocromatinei (benzi G), care posedă proprietăţi diferite (tabelul  2.3)

Benzile G şi Q sunt zone din cromosomi  bogate în heterocromatină, mai compactate, ce conţin puţine gene active şi se replică tardiv spre sfârşitul fazei S; ele posedă ADN bogat în A-T (55-60%) şi numeroase secvenţe repetitive LINES.

Benzile R sunt arii cromosomice ce conţin eucromatină, puţin condensată, cu o mare densitate de gene structurale, active; ADN lor se replică precoce, la începutul fazei S  şi este bogat în perechi de baze G-C (60%), cu numeroase secvenţe repetitive SINES (în special din familia ALU). De aceea anomaliile cromosomice care implică benzile R au consecinţe clinice importante.

Benzile C, situate în regiunea centromerică, sunt alcătuite din heterocromatină constitutivă. Aceasta se mai găseşte pe braţul lung al cromosomului Y, constricţiile secundare şi sateliţii cromosomilor acrocentrici. Deoarece heterocromatina este lipsită de gene sau genele sunt inactive, modificări structurale în aceste zone nu produc efecte fenotipice.

 

            Tabelul 2.3  Caracteristicile benzilor comosomice

(modificat după Miller O.J., 1996)

Caracteristici	Benzi – R	Benzi – Q sau G	Benzi – C
Localizare	Braţe cromosomice	Braţe cromosomice	Centromere, Yq
Tip de cromatină	Eucromatină	Heterocromatină	Heterocromatină
Tip secvenţe ADN	Unice, unele repetitive	Repetitive, unele unice	Înalt repetitive – ADN satelit
Compotiţia bazelor	Bogate în GC	Bogate în AT	Bogate în AT, unele în GC
Secvenţe repetitive	SINEs	LINEs	ADN satelit
Replicare	Precoce	La mijloc sau sfîrşit S	Tardivă
Transcripţie	Intensă	Redusă	Absentă
Densitate gene Insule bogate în CpG	Numeroase	Puţine	Absente
Tip de gene	Gene comune	Gene specific-tisulare	Absente

 

3.2.TEHNICI  DE  ANALIZĂ   A  CROMOSOMILOR

            a). Metode de obţinere a cromosomilor.     

            Analizele citogenetice se pot realiza pe cromosomii metafazici sau prometafazici, obţinuţi din celule care se divid rapid în culturi celulare (limfocite, fibroblaste, celule fetale etc) sau, în unele cazuri, direct din ţesuturi cu activitate mitotică intensă (măduvă osoasă, trofoblast, tumori).

            (1). Metodele citogenetice de rutină folosesc culturi de limfocite  din sângele periferic (produsul cel mai accesibil pentru studiu).

O probă de 0.5 ml  sânge heparinat (recoltată steril) este incubată 48-72 ore (la 37^o) într-un mediu nutritiv, la care se adaugă ser uman sau de viţel (pentru a îmbogăţi conţinutul în proteine şi factori de creştere) şi fitohemaglutinină (pentru a stimula multiplicarea limfocitelor T). Cu puţin timp înainte de terminarea culturii, mitozele sunt blocate în metafază cu colchicină, substanţă ce inhibă formarea fusului de diviziune şi trecerea în anafază. Apoi, mediul este înlocuit cu o soluţie salină hipotonă, care "umflă" celulele şi dispersează cromosomii; Urmează fixarea celulelor, etalarea lor pe o lama microscopică şi colorarea (cu Giemsa). Preparatele sunt examinate la microscop, se numără cromosomii (obişnuit 16 metafaze; 32 în cazul suspiciunii unui mozaic cromosomic) şi se analizează morfologia lor; metafazele selecţionate sunt fotografiate. Cromosomii, din fotografiile obţinute după mărire, sunt decupaţi, identificaţi şi apoi aranjaţi în cariotip, pe baza criteriilor morfologice, în perechi de omologi şi grupe. Se analizează atent morfologia şi modelul în benzi a fiecărui cromosom. Tehnica de analiză cromosomică este o metodă laborioasă, complexă şi costisitoare, necesitând o pregătire şi o dotare specială. În condiţii obişnuite, un rezultat complet nu poate fi obţinut decât în 1-2 săptămâni. Există însă şi sisteme de analiză computerizată a metafazelor care furnizează rapid şi corect cariotipul celulelor analizate; sunt însă scumpe şi necesită un dialog permanent "om -maşină".

            (2). Metodele speciale folosesc culturi din alte tipuri celulare: măduvă osoasă; fibroblaste obţinute prin biopsie de piele; celule fetale recoltate prin amniocenteză sau biopsie de trofoblast (placentocenteză); ele au dezavantajul prelevării mai dificile şi a unui timp mai lung de cultură.  Există deasemeni variante tehnice ce permit studiul cromosomilor în prometafază, evidenţierea situsurilor fragile[20] sau a sindroamelor cu rupturi cromosomice

            (3) Metodele  directe (fără cultură) se aplică, în anumite situaţii, ţesuturilor ce se divid activ: măduvă osoasă în  leucemii; tumori solide; vilozităţi coriale, în diagnosticul prenatal. Aceste metode dau rezultate rapide (3-12 ore) dar numărul metafazelor analizabile este variabil şi calitatea cromosomilor mediocră. Metodele directe se pot folosi şi pentru studiul cromosomilor meiotici, mai ales din spermatocite, la bărbat.

            b). Tehnici de analiză cromosomică.

            Din 1956 şi până în prezent tehnicile de analiză cromosomică au evoluat permanent, putându-se deosebi schematic patru generaţii de tehnici.

            (1) Tehnicile de generaţia I-a (1956). Cromosomii obţinuţi prin metodele prezentate mai sus şi fără alt tratament sunt uniform coloraţi ("solid staining") şi au puţine repere pentru identificarea lor precisă (figura 2.20 a). Folosirea actuală a metodelor ce colorează uniform cromosomii este limtată la diagnosticul aneuploidiilor şi mozaicurilor cromosomice, investigarea situsurilor fragile, a rupturilor cromosomice şi polimorfismului cromosomic.

            (2) Tehnicile de generaţia II-a (1970) sunt tehnici de marcaj cromosomic în benzi a cromosomilor metafazici. Folosind o serie de tratamente şi/sau coloraţii speciale a ADN  se vizualizează pe cromosomii metafazici o structură specifică de benzi alternative intens colorate şi puţin colorate. Se evidenţiază astfel 300-400 benzi pentru un set haploid de cromosomi metafazici.  Aceste tehnici permit identificarea precisă a fiecărui cromosom (figura 2.20 b) şi caracterizarea majorităţii anomaliilor cromosomice (exceptând microdeleţiile).

Marcajul G se obţine prin digestie controlată cu tripsină, urmată de colorarea cu Giemsa. Tehnica este relativ simplă şi larg folosită; are dezavantajul că nu colorează telomerele cromosomilor (figura 2.21)

Marcajul Q se obţine prin colorarea cromosomilor cu un fluorocrom ce se fixează preferenţial pe regiunile ADN bogate în AT (ex. Quinacrina, DAPI, Hoechst 33258); benzile Q fluorescente (observabile în UV) au aceiaşi distribuţie ca şi benzile G. Metoda are dezavantajul că preparatele nu sunt permanente şi necesită un echipament special de microscopie. Este utilă în special pentru analiza cromosomului Y.

Marcajul R (de la ”Reverse”) are o dispoziţie inversă benzilor G şi poate fi obţinut prin denaturarea termică controlată (85º) a preparatelor într-o soluţie salină, înaintea colorării cu Giemsa sau prin folosirea unor coloranţi specifici pentru regiunile bogate în GC (ex., chromomicina A3); benzile colorate se numesc benzi R (ele corespund benzilor G sau Q negative). Un subset de benzi R este reprezentat de marcajul T în care capetele cromosomilor apar intens colorate. Realizează o foarte bună diferenţiere a benzilor şi telomerelor, dar este laborioasă şi influenţată de o serie de factori ce trebuie bine cunoscuţi şi standardizaţi. (figura 2.22)

Marcajul C evidenţiază heterocromatina Constitutivă, în special la nivel centromeric; se obţine după denaturarea cu o soluţie saturată de hidroxid de bariu, înainte de colorarea cu Giemsa.

Alte metode (NOR, pentru evidenţierea regiunilor organizatoare de nucleoli; studiul replicării, în special a cromosomilor X, cu ajutorul bromodeoxiuridinei) etc. – sunt tehnici foarte speciale, utilizate doar pentru caracterizarea unor remanieri cromosomice complexe.

            Unele tehnici de marcaj (R şi G) sunt folosite curent pentru analiza morfologiei cromosomilor, producând setul complet de benzi; alte tehnici (benzi Q, C, T, metodele de marcaj al replicării cu BrdU, coloraţia NOR,ş.a.) se folosesc în analiză numai în anumite situaţii, pentru a defini mai bine anumite subseturi de benzi precum şi tipul de aberaţii structurale ale cromosomilor.

            (3) Tehnicile de generaţia III-a (1977) sunt tehnici de marcaj de înaltă rezoluţie care studiază cromosomii în primele faze ale diviziunii, când ei sunt mai puţin condensaţi. Fiecare bandă din cromosomii metafazici poate fi astfel subdivizată în mai multe sub benzi (figura 2.23). Se pot identifica 550 sau 850 de benzi, corespunzător prometafazei sau profazei. Fiecare bandă corespunde probabil la 20-30 de gene, aceasta fiind limita maximă de rezoluţie în analiza citogenetică convenţională. Aceste tehnici permit evidenţierea unor modificări mici (de ex. microdeleţii) din structura cromosomilor.

Marcajul de înaltă rezoluţie se obţine prin folosirea tehnicilor de marcaj G sau R pentru procesarea cromosomilor aflaţi în primele faze ale diviziunii (prometafază, profază). Aceasta necesită blocarea sintezei de ADN, pentru sincronizarea tuturor celulelor şi, apoi, reluarea sintezei şi oprirea culturii într-un moment în care numeroase celule se află la sfârşitul profazei. Datorită complexităţii lor tehnicile de înaltă rezoluţie nu sunt proceduri de rutină. Se folosesc atunci când se suspectează o anomalie structurală fină (de ex. microdeleţia unei părţi dintr-o bandă cromosomică).

            (4) Tehnicile de generaţia IV-a (1991) sunt tehnici de citogenetica moleculară. Ele folosesc "sonde" de ADN monocatenar, specifice unei anumit cromosom, regiuni cromosomice (centromer sau telomere) sau unor gene cu localizare cunoscută în anumite zone. Sondele se fixează (hibridizează) prin complementaritate în aceste situsuri "ţintă". Pentru a fi evidenţiate după hibridizare, sondele sunt 'marcate' cu un fluorocrom (vizibil la microscopul cu lumină UV). De aceea metoda se numeşte hibridizare fluorescentă in situ sau, prescurtat, FISH (de la Fluorescence In Situ Hybridization). (caseta 2.3)

FISH este o metodă performantă (rezoluţia pe cromosomi metafazici este de câteva megabaze) dar dificilă şi scumpă. Ea are indicaţii precise şi nu se substituie celorlalte tehnici citogenetice. Se foloseşte pentru: suspiciunea clinică / citogenetică a unei microdeleţii (figura 2.24.a şi b) sau microduplicaţii, a unor translocaţii criptice sau deleţii telomerice; detecţia sexului genetic sau a unor aneuploidii în nucleii interfazici (FISH “interfazic”; figura 2.24.c), mai ales din celulele fetale (diagnostic prenatal); caracterizarea unor remanieri complexe sau a unor cromosomi markeri, mai ales în celulele tumorale; detectarea unor secvenţe de Y la bărbaţii XX; evaluarea unui mozaicism.

 

            3.3. CLASIFICAREA ŞI  NOMENCLATURA CROMOSOMILOR  UMANI 

            Identificarea cromosomilor umani se face pe baza morfologiei lor, utilizând criterii precis codificate la diferite conferinţe internaţionale de standardizare. Clasificarea actuală utilizează "International System of Human Cytogenetic Nomenclature" (ISCN)(1995)

            Pe baza lungimii şi poziţiei centromerului cromosomii umani au fost clasificaţi în 7 grupe, notate (convenţional) de la A la G (tabel 2.4). Autosomii sunt desemnaţi fiecare printr-un număr de la 1 la 22. Se obţine astfel, o aranjare sistematizată a cromosomilor unei celule numită cariotip (figura 2.21 şi 2.22).

 Tabel 2.4 Clasificarea pe grupe a cromosomilor umani

CROMOSOMI	Metacentrici	Submetacentrici	Acrocentrici
mari	A (1-3)*	B (4-5)	–
mijlocii	E (16)	C (6-12,X)	D (13-15)
mici	F (19-20)	E (17-18)	G (21-22,Y)

          * Cromosomul 2 este mai submetacentric.

   CASETA  2.3.

Hibridizarea  fluorescentă  in  situ (FISH)

 

            Principiul acestei metode de citogenetică moleculară este hibridizarea prin complementaritate, a unei sonde de ADN monocatenar (de circa 40 kb) cu o anumită regiune a unui cromosom. Sonda ADN este marcată fie direct prin încorporarea unui nucleotid- fluorescent, fie indirect prin încorporarea unui nucleotid modificat ce conţine o moleculă "reporter" (cum ar fi biotina sau digoxigenina) care este recunoscută de un ligand specific (streptavidina pentru biotină şi anticorpi specifici pentru digoxigenină) conjugat cu un flourocrom.

            Sondele pot fi clasificate în 4 tipuri, în funcţie de aplicaţia practică:

Sonde specifice unui locus dat, pentru detectarea deleţiilor sau duplicaţiilor submicroscopice; dacă sonda NU se fixează pe zona cromosomică căreia îi corespunde (absenţa semnalului colorat), atunci se poate concluziona deleţia (pierderea) acestei zone; apariţia a două semnale indică o microduplicaţie. Astfel, se pot decela anomalii segmentare foarte mici, la limita de rezoluţie a microscopului optic. Acest tip de sonde se folosesc şi pentru stabilirea precisă a punctelor de ruptură în cazul translocaţiilor.

Sonde centromerice (alfoide) pentru identificarea centromerului unui anumit cromosom; pot fi utilizate în nucleii interfazici sau pe cromosomii metafazici

Sonde telomerice.

Sonde specifice unui cromosom permit "colorarea" particulară a unui /unor cromosomi (chromosome painting); "pictura cromosomică"  poate evidenţia remanieri cromosomice mici; în acest grup se includ şi sondele corespunzătoare ADN genomic, folosite în hibridizarea genomică comparativă.

            Ţintele sunt multiple:

ADN din cromosomii metafazici; nivelul de rezoluţie este de ordinul a 1-3 Mb

ADN din nucleii interfazici ai celulelor fetale; hibridizarea unor  sonde de ADN specifice anumitor cromosomi (de ex. 21, 18, 13, X şi Y) cu nuclei interfazici permite diagnosticul prenatal rapid (fără cultură) al unor anomalii de număr ale cromosomilor respectivi, fără să fie nevoie de efectuarea cariotipului (ex. trei spoturi fluorescente obţinute cu sonda pentru cromosomul 21 pune diagnosticul de trisomie 21); nivelul de rezoluţie este de ordinul 100 Kb.

Molecule de ADN prealabil "alungite" prin procedee fizice sau chimice; această metodă permite individualizarea a două sonde distanţate la 1 Kb.

Întregul cromosom. Prin folosirea unui amestec de secvenţe ce corespund diferitelor părţi dintr-un anumit cromosom se poate obţine colorarea sa integrală cu un anumit fluorocrom ("chromosome painting"). Metoda a fost ulterior dezvoltată: folosind sonde cu secvenţe din fiecare cromosom, o combinaţie de mai mulţi fluorocromi (Multiplex FISH) şi analiza digitală automată a imaginilor (cu o cameră CCD) este posibilă colorarea diferită a fiecărui cromosom din cariotip. O variantă a acestei metode este cariotiparea spectrală (SKY) ce utilizează combinaţii variate a cinci probe fluorescente, o cameră specială de luat imagini şi un soft de procesare a imaginilor ce permite ca fiecare cromosom să aibe o coloraţie particulară, unică, ce face posibilă detectarea oricărui rearanjament cromosomic.

Întregul genom. O metodă larg folosită  în studiile citogenetice în cancer este Hibridizara Genomică Comparativă (CGH): ADN test (de ex., tumoral) este marcat cu un fluorocrom verde iar ADN normal (control) cu unul roşu; cele două probe, amestecate, sunt hibridizate cu cromosomi metafazici normali. Raportul semnalului verde sau roşu pe cromosomii metafazici hibridizati indică localizarea unei duplicaţii (exces de verde) sau deleţii (exces de roşu) din ADN test

 

            Identificarea precisă a cromosomilor în cadrul fiecărei grupe nu este posibilă fără ajutorul marcajului în benzi. Un exemplu edificator este prezentat în figura 2.20 în care se observă că fără marcajul benzii este imposibil de făcut deosebirea între cromosomii grupei D (13-14-15); acest lucru devine facil prin tehnicile de marcaj, fiecare cromosom având o distribuţie specifică a benzilor. Modelul de marcaj în benzi a tuturor cromosomilor umani şi nomenclatura lor este prezentat în figurile 2.25 şi 2.26.

            La cromosomii  cu marcaj, în lungul cromatidelor există diferite "repere specifice" (centromerul, unele benzi mai importante, telomerele) care împart fiecare braţ în regiuni cromosomice, numerotate pentru fiecare braţ, de la centromer spre telomere (p1, p2, p3…şi q1, q2, q3…); ele sunt divizate în mai multe benzi: p11 (unu-unu, nu unsprezece), p12, p13.. (fig. 2.21). Dacă prin tehnici mai fine (prometafază) banda este divizată în sub-benzi, ele sunt numerotate ca sub-seturi ale benzii originale (de ex. banda 18 q22 poate fi divizată în 18 q22.1, 18 q22.2 şi 18 q 22.3). La cromosomii profazici pot apare şi sub-sub-benzi (ex.,18 q22.11. Conform unor standarde internaţionale, fiecare bandă este definită numeric prin numărul cromosomului, braţul, regiunea, banda, sub-banda; de ex. Xp21.2 înseamnă banda 1, subbanda 2 a regiunii 2 de pe braţul scurt al cromosomului X.

            Pentru a descrie sintetic un cariotip normal sau anormal, International System for human Cytogenetics Nomenclature (ISCN, 1995) a stabilit un sistem de nomenclatură şi o serie de abrevieri. Formula de bază cuprinde 3 itemuri, separate prin virgulă: primul precizează numărul de cromosomi, al doilea constituţia (normală / anormală) a cromosomilor sexuali, iar al treilea (prezent în funcţie de situaţie) anomaliile de număr sau structură ale autosomilor (reprezentate prin abrevierile din tabelul 2.5). Prezenţa unui mozaic cromosomic este indicată printr-o diagonală (/) care separă cariotipurile liniilor celulare componente.

46,XX sau 46,XY                                – cariotip normal feminin sau masculin;

Monosomie X    45,X                                     – 45 cromosomi, un singur cromosom X;

Trisomie            47,XXY                   – 47 cromosomi cu doi X şi cu un Y;

Trisomie            47,XX,+21      – 47 cromosomi, la o persoană cu sex  genetic  feminin şi  

                                                      un cromosom 21 suplimentar (trisomie 21);

Mozaic               45,X/46,XX                          – mozaic cromosomic cu două linii  celulare  una cu

                                                      cromosomi şi un singur  X, alta normală;

 

Tabel 2.5  Simboluri folosite în descrierea cariotipului

(după ISCN, 1995)

A-G	Grupele cromosomice	dup	duplicaţie
1-22	Numerele autosomilor	dic	dicentric
X, Y	Cromosomii sexuali	fra	situs fragil
/	mozaicism	i	isocromosom
p	braţ scurt	ins	inserţie
q	braţ lung	inv	inversie
pter	capăt braţ scurt	mat	origine maternă
qter	capăt braţ lung	pat	origine paternă
cen	centromer	r	cromosom inelar
h	heteromorfism	t	translocaţie
del	deleţie	upd	disomie uniparentală
der	rearanjament cromosomic sau cromosom derivat	::	rupere cu reunire
+/–	înaintea numărului unui cromosom indică adăugarea / pierderea cromosomului întreg; după un număr cromosomic indică adăugrea / pierderea unei părţi din cromosom

                       

            Pentru a defini mai amplu o anomalie de structură cromosomică (un rearanjament) se poate folosi sistemul de numerotare al benzilor şi precizarea punctelor de ruptură. Există două forme de nomenclatură: una scurtă – în care se precizează cromosomii implicaţi şi punctele de ruptură; alta detaliată – care identifică punctele de ruptură şi segmentele cromosomice de la un telomer la altul[21]. În practica medicală se foloseşte mai ales sistemul scurt; cele mai frecvente anomalii de structură (prezentate în capitolul 8) sunt notate astfel:

                        Anomalii de structură

            Deleţie                                                  46,XY,5p

            Deleţie terminală                                   46,XY, del (5)p14

            Deleţie interstiţială                                 46,XX,del(5)(p14p15.2)

            Duplicaţie                                             46,XX,dup(1)(q11->q32)                   

            Inversie                                                46,XX,inv(4)(p15q13)            

            Inserţie                                                 46,XX,ins (6;12)(p21;q13q23)

            Isocromosom X de braţ lung                 46,Xi(Xq)                                           

            Marker                                                 47,XX,+mar

            Cromosom inelar                                  46,XX,r(18)(p11q22) 

            Situs fragil                                             46,XY,fraX(q28)                                

            Translocaţie reciprocă echilibrată          46,XY,t(2;8)(p13;q12)            

            Translocaţie robertsoniană                    45,XX,t(13;14)(q11;p11)                    

                                   

            Pentru a exemplifica sistemul detaliat (utilizat de specialişti) redăm nomenclatura a două anomalii de structură prezentate mai sus:

                        46,XX,inv(4)(p ter->q15::q13->p15:q13->qter)

                        46,XY,t(2;8)(2pter->2p13::8q12->8pter; 2qter ->2p13::8q12 ->8qter)

       

            3.4. HETEROMORFISMUL   CROMOSOMILOR

            Prin diferite tehnici de studiu s-au evidenţiat variaţii în morfologia cromosomilor omologi la un individ sau la persoane diferite (din familie sau populaţia generală). Aceste variaţii au fost numite (la Conferinţa Paris, 1971) heteromorfism cromosomic[22] iar cromosomul care se deosebeşte morfologic de omologul său este considerat a fi un cromosom marker. Deoarece regiunile cromosomice heteomorfice sunt arii de heterocromatină, bogate în ADN repetitiv şi inactiv genetic, mărimea lor variabilă este fără consecinţe fenotipice ("variante normale"). Unele studii relevă totuşi o frecvenţă mai mare a acestor variante heterocromatinice la clupurile cu avorturi spontane repetate sau în grupul persoanelor cu retard mintal; semnificaţia acestui fenomen este necunoscută.

            S-au descris patru tipuri majore de heteromorfism cromosomic:

mărimea cromosomului Yp (10% din bărbaţii normali au un Y mai lung sau mai scurt decât deobicei),

mărimea heterocromatinei centromerice (benzi C) sau juxtacentromerice (mai ales la cromosomii 1,9,16), 

polimorfismul sateliţilor (în mărime),

situsurile fragile induse de antifolaţi (peste 5% din populaţie are  60 tipuri diferite de situsuri).

            Fiecare persoană posedă un heteomorfism particular (are cel puţin un cromosom marker) cu aceiaşi valoare ca şi amprentele sale; deobicei markerul se transmite nemodificat de la părinte la copil (ca un caracter dominant), putând fi folosit uneori în determinarea paternităţii)

INTERNET

 

Dicţionar de biologie celulară: http://www.mlab.gla.ac.uk/~julian/Dict.html

European Bioinformatics Institute (EBI): http://www.ebi.ac.ku

Indiana University Biotechnology: http://www.biotech.chem.indiana.edu

Genome Data Base: http://gdbwww.gdh.org/

Genethon (France): http://www.genethon.fr

National Center for Genomic Resources: http://www.ncgr.org

National Center for Biotechnology information (NCBI): http://www.ncbi.nlm.nih.gov/

National Human Genome Research Institut: http://www.nhgri.nih.gov

Nature –Genome gateway: http://www.nature.com/genomics/huamn

Institute for genomic research: http://www.ftp.tigr.org

Citogenetica: http://www.kumc.edu/gec/geneinfo.html

Citogenetică moleculară: http://www.mpimg-berlin-dahlem.mpg.de/~cytogen/

 

Bibliografie specifică  selectivă

 

Bernardi G. Human genome organization . Curr.Opin,Genet.Develo. 1995; 5:315-322

Deloukas P. et al The DNA sequence of human chromosome  20. Nature  2001; 414:865-871

Dunham I. et al. The DNA sequence of human chromosome  22. Nature  1999; 402:489-495

Ekong R, Wolfe J – Advances in fluorescence in situ hybridization – Curr. Opin. Biotechnol. 1998, 9, 19-24.

Ferguson-Smith M.A., Andrews T. – Cytogenetics analysis  – in "Emery and Rimoin Principles and practice of Medical Genetics"  3^rd Edn, ed. D.L Rimoin, J.M. Connor, R. E. Pyeritz. 1996, Churchil Livingstone, New York. London. 1996, p. 253- 276.

Gardiner K. Human genome organization. Curr.Opin.Genet.Develop. 1995; 5:445-476

Hattori M. et al. The DNA sequence of human chromosome  21. Nature  2000; 405:311-319

Heard E, Clerc P, Avner P – X-chromosome inactivation in mammals – Annu.Rev.Genet., 1997, 31, 571-610.

Heng HHQ, Spyropoulos B, Moens PB – FISH technology in chromosome and genom research –BioEssays 1997, 19,75-84

Horn P.J., Peterson L.C. Chromatin higher order folding wrapping up transcription. Science 2002; 297:1824-1827.

International Human Genom Sequencing Consortium. Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature 2001; 411:860-920

Knight S.J.L., Flint J. Perfect endings: a review of subtelomeric probes and their use in clinical diagnosis. J.Med.Genet. 2000; 37:401-409.

Lyon MF –  X-chromosome inactivation – Curr. Biol., 1999, 9, R235-R237

Manuelidis L – A view of interphase chromosomes – Science, 1990, 250, 1533-1540.

Migeon BR – X-chromosome inactivation: molecular mechanism and genetic consequences – Trends Genet., 1994, 10, 230-235.

Miller O.J. – Chromosomal Basis of Inheritance – in "Emery and Rimoin Principles and practice of Medical Genetics"  3^rd Edn, ed. D.L Rimoin, J.M. Connor, R. E. Pyeritz., Churchil Livingstone, New York. London. 1996, p.235-252.

Mittelman F (ed) – An International System for Human Cytogenetic Nomenclature (ISCN)- Karger, Basel, 1995.

Peltonen L., McKusick V.A. Dissecting human disease in the postgenomic era. Science 2001; 291:1224-1229

Rosenthal N.- DNA and the genetic code – N.Engl.J.Med., 1995; 331:39-41

Saitoh Y, Laemmli UK – Metaphase chromosome structure: bands arise from a differential folding path of the highly AT-rich scaffold- Cell, 1994, 76, 609-622.

Speicher M.R., Ward D.C. The coloring of cytogenetics. Nature med. 1996; 2:1046-1049

Sutherland G.R., Baker E., Richards R.I. Fragil sites still breaking. TIG, 1998; 14:501-505

Tyler-Smith C., Willard HF.- Mammalian chromosome structure – Curr. Opin. Gene Dev., 1993, 3, 390-397.

Venter J.C., Adams M.D., Myers E.W. et al. The sequence of the human genome. Science 2001; 291: 1304-1351

Walace D.C., Brown M.D., Lott M.T.  – Mitochondrial Genetics – in "Emery and Rimoin Principles and practice of Medical Genetics"  3^rd Edn, ed. D.L Rimoin, J.M. Connor, R. E. Pyeritz., Churchil

Wolffe A. Mithocondrial disease in man and mouse. Science; 283:1482-1488