RIA (Radio Immuno Assay)
Antigenul este incubat pe o suprafata solida (plastic) si adsorbit la aceasta. Antigenele nelegate sunt indepartate prin spalare.
Suprafata solida este tratata cu o proteina irelevanta (blocata) pentru a preveni legarea ulterioara nespecifica.
Se adauga anticorp test (cu specificitate cunoscuta, dedicata antigenului respectiv). Excesul de anticorp este indepartat prin spalare.
Anticorpul legat este identificat cu ajutorul unui ligand radioactiv. Ligandul ar putea fi o molecula precum proteina A a stafilococului, care se leaga la fragmentul Fc al IgG, sau un anticorp secundar. Excesul de ligand este indepartat prin spalare.
Radioactivitatea placii este masurata cu ajutorul unui contor (gamma counter). Prin utilizarea unei cantitati crescande de ligand radiomarcat se obtine o curba de titrare, cu valori incepand de la „zgomotul de fond” (background) pana la un maximum (platou liniar). In mod obisnuit, platoul are valori de 20-100 de ori mai mari decat background-ul.
Curba de titrare poate fi utilizata pentru determinari cantitative doar in portiunea ei liniara!
O anumita cantitate de antigen liber (in solutie) va lega anticorpii si ii va impiedica sa se lege la suprafata solida. Astfel, radioactivitatea placii va fi proportional mai mica.
Sensibilitatea metodei este de cca 1-50 ng/ml anticorp.
