Reacţia de aglutinare
Legarea unui anticorp la antigene multivalente particulate (particule insolubile) conduce la “cross-linking” al diferitelor antigene şi la eventuala aglomerare (aglutinare) a particulelor antigenice.
Titru. Aglutinarea unui antigen ca rezultat al cross-linking-ului de către anticorpi depinde de proporţia corectă de antigen şi anticorp. Pentru măsurarea nivelului de anticorpi serici specifici pentru antigene particulate este uneori utilizată o metodă care se bazează pe aglutinare. Astfel, titrul anticorpilor se referă la concentraţia cea mai mică de anticorp (diluţia cea mai mare) la care reacţia încă se mai poate produce. Măsurarea titrului de aglutinare reprezintă o metodă semi-cantitativă (nu este o metoda cantitativă a concentraţiei de anticorp – greutate/volum). Testul se efectuează prin amestecarea unor dilutii 2x seriate de ser cu o concentraţie fixă de antigen. Diluţii mari de ser nu vor conduce la aglutinare deoarece nu există suficiente molecule de anticorp pentru a produce o aglutinare vizibilă.
Nici în cazul unei concentraţii prea mari de anticorp reacţia de aglutinare nu apare întotdeauna – prozonă. În această situaţie avem de a face cu un exces de anticorp.
Astfel, testarea serului la o singură diluţie poate coduce la rezultate false: absenţa aglutinării poate să însemne nu numai absenţa anticorpilor, dar şi situarea în prozonă.
Potenţialul zeta. Suprafaţa anumitor antigene particulate poate să fie încărcată cu o anumită sarcină electrică: de ex., sarcina electrică negativă netă de pe suprafaţa hematiilor este cauzată de prezenţa acidului sialic. Când astfel de particule încărcate sunt suspendate în soluţie salină, între particule apare un potenţial electric numit zeta, care le îimpiedică să se apropie una de cealaltă. Acest potenţial crează un obstacol suplimentar în realizarea aglutinării prin intermediul anticorpilor a particulelor încărcate electric, în particular a eritrocitelor de către IgG. Distanţa dintre braţele Fab ale IgG, chiar şi în forma cea mai extinsă, este prea scurtă pentru a realiza legarea (unirea) a 2 hematii depăşind potenţialul zeta. Astfel, deşi IgG reacţionează specific cu antigene de pe suprafaţa eritrocitelor, aglutinarea nu se produce datorită respingerii determinate de potenţialul zeta. În schimb, unele Fab ale IgM sunt suficient de depărtate şi pot determina legarea eritrocitelor. Această proprietate a anticorpilor IgM, împreună cu faptul că sunt multivalenţi, reprezintă principalele motive pentru eficienţa lor în realizarea aglutinării.
Testul Coombs (testul anti-imunoglobulinic): implică anticorpi direcţionaţi împotriva imunoglobulinelor. Se bazează pe următoarele aspecte:
- imunoglobulinele provenind de la o specie sunt imunogenice dacă sunt introduse într-un organism aparţinând altei specii şi conduc la producţia de anticorpi împotriva imunoglobulinelor
- multe dintre anti-imunoglobuline se leagă la determinanţi antigenici prezenţi la nivelul porţiunii Fc şi lasă fragmentul Fab să se lege la antigen. Astfel, dacă IgG umane se leagă la eritrocite, adăugarea de anticorpi de iepure (de ex.) anti IgG uman va conduce la legarea la porţiunile Fc ale anticorpilor umani. Aceşti anticorpi de iepure nu numai că se leagă la anticorpii umani care sunt legaţi la eritrocite dar formează şi punti între moleculele de IgG uman de pe eritrocite aflate la o distanţă relativă una de cealaltă, învingând bariera potenţialului zeta. Apare astfel aglutinarea.
Adăugarea de anti-imunoglobuline conduce la aglutinare, chiar dacă anticorpii direcţionaţi împotriva eritrocitelor sunt într-o concentraţie atât de mare încât să determine fenomenul de prozonă.
Există două variante ale testului Coombs: direct şi indirect.
În testul direct, anti-imunoglobulinele sunt adăugate la particule (ex. eritrocite) care sunt suspectate că ar avea anticorpi legaţi la suprafaţa lor. De ex., dacă un nou născut este suspect de boală hemolitică produsă de anticorpi materni anti-Rh, adăugarea de anti-imunoglobuline faţă de IgG materne s-ar lega la acestea şi ar conduce la aglutinare.
În testul indirect, se urmăreşte detectarea prezenţei în ser de anticorpi specifici pentru antigenele de pe suprafaţa unei anumite particule. Anticorpii adăugaţi peste particule nu conduc la aglutinare, posibil din cauza efectului zeta. Dacă însă se adaugă ulterior anti-imunoglobuline, acestea va conduce la aglutinare. O aplicaţie obişnuită a testului Combs indirect este detecţia anticorpilor IgG anti-Rh din sângele femeilor Rh negative. Serul femeii este adăugat peste eritrocite Rh+, apoi este adăugat anticorp anti-imunoglobulinic.
Aglutinarea pasivă. Reacţia de aglutinare poate fi utilizată şi în cazul unor antigene particulate, dar şi al unor antigene solubile, cu condiţia ca acestea din urmă să fie ataşate ferm la suprafţta unor particule insolubile. De ex., antigenul solubil numit tiroglobulină poate fi ataşat la particule de latex, astfel încât adăugarea de anticorpi anti-tiroglobulina să producă agregarea particulelor.
Adăugarea de antigen solubil peste anticorpi (ser) înainte de adăugarea particulelor de latex tapetate cu tiroglobulină va determina legarea celor două componente şi aglutinarea nu se va mai produce – test de inhibiţie a aglutinării.
Când aglutinarea apare ca o consecinţă a legării unui constituient natural de pe suprafaţa particulei acest fenomen se numeşte aglutinare directă. Dacă aglutinarea are loc între anticorpi şi antigene solubile care au fost ataşate la particule, reacţia este denumită aglutinare pasivă.
